[发明专利]用于早期糖尿病诊断的多肽标志物

权利要求书

1.一种用于早期糖尿病诊断的内标多肽，其特征在于，其来源于人血清白蛋白，具有SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。

2.权利要求1所述的内标多肽在制备早期糖尿病诊断试剂盒中的应用。

3.一种筛选权利要求1所述内标多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）体外糖基化样品的制备，将无菌HSA于50mM pH7.4的PBS缓冲液中配成生理浓度的溶液，分别与4种不同浓度的D-葡萄糖在37℃水浴共同孵育10、20和30天，使得HSA与D-葡萄糖的摩尔比分别为1:10、1:41.5、1:83和1:415；以同样条件下不添加D-葡萄糖溶液的反应体系作为空白对照；

（2）胰酶消化，蛋白样品溶于50mM pH8.3的NH₄HCO₃缓冲液中，向每200μg经糖基化的HSA与空白对照HSA样品中加入20μL含8M尿素的10mM DTT溶液进行变性，于37℃水浴孵育4h，再加入50mM IAA溶液甲基化封闭氨基酸侧链的活泼基团，于黑暗处反应1h，再加入溶于pH8.3的NH₄HCO₃缓冲液中的胰蛋白酶，使HSA:胰蛋白酶的质量比=10～125:1，于37℃水浴孵育8～20h；

（3）¹⁸O标记，将冻干后的肽段样品溶于50～150mM pH4.0～7.0的KH₂PO₄溶液中后冻干备用；向未经修饰的HSA-肽段和糖基化HSA-肽段加入分别用H₂¹⁸O和H₂¹⁶O溶解的胰蛋白酶，HSA:胰蛋白酶质量比=1～125:1，在37℃水浴中标记8～24小时；

（4）HPLC/ESI-TOF MS方法对样品进行定量分析和用HPLC/ESI-Ion Trap MS方法对样品进行定性分析；

（5）数据分析与内标肽段的选择，Agilent公司Mass Hunter软件的MFE算法用于提取HPLC/ESI-TOF MS的数据特征，提取参数：保留时间8.00-45.00min；质荷比m/z300-1800；信噪比阈值S/N5；谱峰数目1000×1000；选中肽同位素分布；PeakPair软件被用于挑选相应肽段的¹⁶O/¹⁸O峰对，并计算出¹⁶O/¹⁸O峰面积的比值用于肽段的定量分析，若¹⁶O/¹⁸O峰面积的比值小于1，则说明未经修饰的HSA来源的肽段被消耗，该肽段拥有易被修饰的糖基化位点，经过糖基化过程，生成了带有糖链修饰的新肽段；若¹⁶O/¹⁸O峰面积的比值等于1，则说明该肽段经过与葡萄糖共育并未被消耗，不存在对葡萄糖敏感的糖基化位点；在TOF MS数据中，发现1个葡萄糖不敏感肽段AAFTECCQAADKAACLLPK，m/z=977.4,Rt=28.7min均可在每一次质谱检测中稳定地被检测到，质谱信号达到10⁵，肽段的¹⁶O/¹⁸O峰面积比例最接近1，且SD值最小0.961±0.077，选择该肽段为内标肽段。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）还包括在标记完成后，残余的胰蛋白酶需经灭活处理，将样品在沸水中煮10分钟，再按照体积比加入5%的甲酸。

5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤（3）中标记体系尿素浓度控制在2M以下。

6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，在HPLC/ESI-TOF MS分析之前，样品需经过离心处理，离心条件为17,000×g,15min。

7.一种与权利要求1所述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物，其特征在于，其来源于人血清白蛋白，具有SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。

8.一种与权利要求1所述内标多肽联合使用用于检测早期糖尿病的多肽标志物，其特征在于，其来源于人血清白蛋白，具有SEQ ID NO.5所述的氨基酸序列。