[发明专利]一种附子多糖诱导NKT细胞增殖的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种附子多糖诱导自然杀伤T细胞增殖的制备方法及其应用。本发明涉及的采用人外周血、骨髓或脐带血经体外分离纯化获得的单个核细胞，在中药附子多糖和人重组白介素2条件下连续培养，简便地获得大量的NKT细胞，表达NK1.1⁺和CD8⁺，并分泌IFN-γ，具有抗肿瘤和抗病毒的功能，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内，以及多种病毒感染的多个疗程的免疫治疗。

背景技术

免疫细胞抗肿瘤抗病毒已在临床上得到广泛的应用，特别是细胞因子诱导杀伤细胞，没有目前常规治疗带来的毒副作用，其相对安全，保证了患者的生活品质和尊严。构成机体免疫系统的淋巴细胞中，除T、B、NK细胞外，还存在一种新的细胞系-NKT细胞。这种细胞不仅其本身具有抗肿瘤、抗病毒和抑制自身免疫性疾病的功效，而且还能刺激T、NK等免疫细胞的活性，增强其细胞毒效应，抑制GVHD的发生。NKT细胞疫苗多疗程治疗对患者疗效和生存期有着明显的帮助，并得到临床上认可。

目前，获得NKT细胞的来源主要为从患者外周血或骨髓中分离出单个核细胞，在多种细胞因子单独或组合诱导作用下，如重组人白介素2、重组人白介素15、重组人白介素4、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、重组人白介素12、重组人白介素18，或与α-半乳糖神经鞘胺醇(α-Galcer)联合诱导作用，得到NK1.1⁺和TCRβ⁺的NKT细胞，细胞数量级为5×10⁸个左右，仅满足1-2次的临床治疗，很大程度上影响了给患者的治疗，而且多疗程治疗时需要再次采血，给予患者很大的精神压力。

附子多糖对免疫系统有重要的调节作用，不仅能激活T细胞、B细胞、NK细胞、细胞毒细胞和LAK，能有效促使树突状细胞成熟，还能促进白介素、肿瘤坏死因子α、集落刺激因子和干扰素等细胞因子的生成。本发明通过人外周血、骨髓或脐带血中白细胞，经体外纯化获得的单个核细胞，应用附子多糖和重组白介素2联合连续培养，简便地获得大量的NK1.1⁺和CD8⁺NKT细胞，并分泌IFN-γ。这样不仅可以满足多疗程NKT细胞免疫治疗，持续发挥NKT细胞的免疫功能，有助于提高临床疗效和延长患者生存期，而且应用附子多糖可以大大降低成本。

发明内容

现有技术主要通过从人外周血、骨髓或脐带血中分离纯化出单个核细胞，一般为20毫升到300毫升，在多种细胞因子单独或组合诱导作用下，如重组人白介素2、重组人白介素15、重组人白介素4、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、重组人白介素12、重组人白介素18，或与α-半乳糖神经鞘胺醇(α-Galcer)联合诱导作用，连续培养获得NKT细胞，其数量是有限的，仅为5×10⁸个细胞左右。若一次NKT细胞疫苗治疗至少使用5×10⁸个细胞，最多能满足1-2次的治疗。另外，NKT细胞激活后可通过分泌IL-4和IFN-γ调节Th细胞的分化，从而实现对免疫应答和自身免疫的调节。因而，为了实现NKT细胞的抗肿瘤、抗病毒的免疫应答，还需要促使NKT细胞分泌IFN-γ，发挥Th1的细胞免疫应答作用。

NKT细胞能对外源性快速增殖的肿瘤细胞进行杀伤，NKT细胞需要持续地进行加强，维持对机体“非我”的肿瘤细胞进行杀伤，有效地抑制肿瘤细胞的复发和转移。因而NKT细胞疫苗在临床应用中需要进行多次治疗，更好地提高患者临床疗效和延长生存期。通过现有技术获得的NKT细胞数量，没法完成患者的多次的治疗和保证患者的长期疗效。

附子多糖具有促进B、T淋巴细胞增殖的作用，并促使人白细胞分泌干扰素γ、肿瘤坏死因子α等，促使淋巴细胞向Th1细胞分化，而介导免疫应答。本发明技术通过人外周血、骨髓和脐带血经体外纯化获得单个核细胞，经附子多糖和IL-2共同刺激作用，简便地增殖获得大量的NKT细胞，数量级可大于5×10⁹以上，每次治疗时使用0.5×10⁹NKT细胞，可用于多达5次以上。同时NKT细胞可表达NK1.1⁺和CD8⁺，分泌IFN-γ，可产生对肿瘤细胞的Th1细胞免疫应答。