[发明专利]一种附子多糖诱导NKT细胞增殖的制备方法及其应用

权利要求书

1.中药附子多糖诱导自然杀伤T细胞(Nature Killer T cell，NKT)增殖的制备方法，其特征在于人外周血、骨髓或脐带血来源的单个核细胞，在中药附子多糖和人重组白介素2条件下连续培养，获得大量自然杀伤T细胞，表达NK1.1⁺和CD8⁺，并分泌干扰素γ，在第14天时占淋巴细胞的比例12.15％以上，数量级可达5×10⁹以上。 

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于人外周血、骨髓或脐带血经体外分离纯化，去除红细胞、血小板和粒细胞等，获得单个核细胞，单个核细胞用RPMI1640培养基重悬，苔盼兰染色计数，使用RPMI1640完全培养基(含1ug/mL-1000ug/mL附子多糖，1IU-400IU/mL IL-2，10％(v/v)胎牛血清)调整到细胞浓度为1-5×10⁶/mL，将细胞培养液放置到75cm²培养瓶中，每瓶30ml，于37℃、5％CO₂培养箱中培养； 

于第3、6、9、11、13、15、17天补充一倍体积的新鲜RPMI1640完全培养基(含1ug/mL-1000ug/mL附子多糖，IIU-400IU/mLIL-2，10％(v/v)胎牛血清)，培养到第14、16和18天收获NKT细胞。 

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，诱导培养NKT细胞使用的RPMI1640完全培养基优选为含有10ug/mL-500ug/mL附子多糖，5IU-200IU/mL IL-2，10％(v/v)胎牛血清。 

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，将所述的NKT细胞进行细胞增殖和细胞表型检测，苔盼兰计数细胞增殖达到5×10⁹以上；其高表达NKT细胞表型NK1.1⁺和CD8⁺，并分泌干扰素γ(IFN-γ)，其中，在第14天NKT细胞中含NK1.1⁺和CD8⁺双阳性细胞为12.61％以上，酶联免疫斑点检测干扰素γ为30个以上。 

5.权利要求1-4所述制备NKT满足在临床抗肿瘤、抗病毒治疗中的应用。