[发明专利]一种在胰腺组织中特异性表达hDAP基因和DDIT3基因的载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种在胰腺组织中特异性表达hDAP基因和DDIT3基因的载体及其应用。

背景技术

医学研究需要大量建立与人类疾病病理相关的动物模型。能够模拟和体现糖尿病病理生理变化的动物模型将有助于人们更好地理解疾病的本质，为糖尿病的预防和治疗提供理论基础，可为药物靶点筛选、新药开发、高效治疗方式的发现提供试验对象。

使用基因工程技术制备小鼠动物模型，对动物模型的基因组加以改造，可通过特定基因的过表达、基因敲除和基因敲入等方法建模，模拟研究人类糖尿病，比其他方法制备的动物模型更理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种在胰腺组织中特异性表达hDAP基因和DDIT3基因的载体及其应用。

本发明首先提供了一种DNA分子，包括启动子、hDAP基因和DDIT3基因，由所述动子启动所述hDAP基因和所述DDIT3基因的表达；所述启动子如序列表的序列5自5’末端第21-1505位核苷酸所示；所述hDAP基因编码序列表的序列7所示的蛋白质；所述DDIT3基因编码序列表的序列9所示的蛋白质。

所述hDAP基因位于所述DDIT3基因的上游。

所述hDAP基因和所述DDIT3基因之间具有F-2A序列；所述F-2A序列编码序列表的序列8所示的蛋白质。

所述hDAP基因如序列表的序列5自5’末端第1526-1792位核苷酸所示。

所述DDIT3基因如序列表的序列5自5’末端第1901-2407位核苷酸所示。

所述F-2A序列如序列表的序列5自5’末端第1817-1900位核苷酸所示。

所述DNA分子具体可为如下（a）或（b）：（a）序列表的序列5自5’末端第21-2407位核苷酸所示的DNA分子；（b）序列表的序列5自5’末端第21-2423位核苷酸所示的DNA分子。

含有以上任一所述的DNA分子重组载体、表达盒或转基因细胞系均属于本发明的保护范围。所述重组载体具体可为在pGL3-control载体的多克隆位点插入所述DNA分子得到的重组质粒。所述重组载体更具体可为将pGL3-control载体Mlu I和Xba Ⅰ酶切位点之间的小片段取代为序列表的序列5自5’末端第21-2423位核苷酸所示的DNA分子得到的重组质粒。

本发明还保护以上任一所述的DNA分子或重组载体的应用，为如下（1）或（2）或（3）或（4）：（1）制作糖尿病鼠模型；（2）诱发小鼠发生胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗；（3）制备用于制作糖尿病鼠模型的试剂盒；（4）制备用于诱发小鼠发生胰岛素分泌缺陷和胰岛素抵抗的试剂盒。

所述小鼠具体可为C57BL/6J小鼠。

本发明通过胰腺特异启动子启动hDAP基因和DDIT3基因的表达且使其与胰岛素表达的时空特异性保持一致（通过Furin裂解位点和自剪切多肽2A连接实现两个基因的共表达，两个基因在一个表达盒内，表达避免了应用双启动子存在启动子间相互抑制现象可能导致基因表达抑制的弊端，克服了多基因共表达的不均衡性，使基因表达趋于平衡；使用时，可以借助一个重组载体对两个基因进行转化，也避免了多质粒共转化系统中，双载体转化效率问题和多种抗生素选择而带来的困扰），引起小鼠胰岛β细胞启动凋亡应激相关通路，进而使胰岛β细胞数量减少，导致胰岛素分泌绝对不足，产生糖耐量低减，最终很可能出现小鼠空腹血糖持续走高，发生糖尿病，达到建模目的。

附图说明

图1为质粒的结构示意图。

图2为实施例2中对照组转染48小时后的照片。

图3为实施例2中hDAP基因的相对表达量和DDIT3基因的相对表达量。

图4为实施例3中的琼脂糖凝胶电泳图。

图5为实施例3中的Southern杂交结果。

图6为实施例3中部分样本的电泳图。

图7为实施例3中的Western杂交图。

图8为实施例3中荧光定量PCR鉴定DDIT3基因的相对表达量。

图9为实施例3中实验组饲喂27周高脂高糖饲料后进行糖耐量测定的结果。

图10为实施例3中对照组饲喂37周正常饲料后进行糖耐量测定的结果。

具体实施方式