[发明专利]转基因水稻科丰2号品系特异性实时荧光定量PCR检测引物、检测方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及转基因水稻品系特异性的PCR检测引物及检测试剂盒，尤其涉及转基因水稻科丰2号品系特异性的实时荧光定量PCR检测引物、检测方法及检测试剂盒，属于转基因水稻品系特异性检测领域。 

背景技术

随着转基因植物的广泛种植，转基因食品的安全性问题也引起人们极大的关注，已有30多个国家相继实施转基因产品标识制度，包括中国。转基因标识制度的实施依赖于对转基因植物及其加工产品的成分检测。PCR技术是目前国内外检测转基因产品中应用最广泛的方法。在应用这种技术进行转基因作物定性检测时，根据其特异性，将其分为筛选检测法、基因特异性方法、构建特异性方法和品系特异性方法。品系特异性检测是通过检测插入载体与植物基因组的连接区序列实现的，由于每一个转基因植物品系，都具有特异的外源插入载体与植物基因组的连接区序列，和前三种方法比较，品系特异性具有更高的特异性和准确性，最适合做转基因产品检测。 

目前，已有部分专利和文献报道了转基因植物的品系特异性检测方法。例如：张大兵等人于2006年建立了转基因MON863玉米的品系特异性检测 方法；谢家建等人建立了转基因水稻克螟稻、Bt汕优63、科丰6号和科丰8号等一系列品系特异性检测方法；卢长明等人于2007年建立了一系列转基因油菜的品系特异性检测方法。但是，迄今为止，缺乏一种转基因水稻科丰2号的品系特异性的实时荧光定量PCR检测方法。 

发明内容

本发明的目的之一是提供用于检测转基因水稻科丰2号的品系特异性实时荧光定量PCR检测引物及探针； 

本发明的目的之二是建立一种转基因水稻科丰2号的品系特异性实时荧光定量PCR检测方法； 

本发明的目的之三是提供一种转基因水稻科丰2号的品系特异性实时荧光定量PCR检测试剂盒。 

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的： 

本发明首先提供了一对用于检测转基因水稻科丰2号的品系特异性实时荧光定量PCR检测引物以及探针，所述引物对的核苷酸序列分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。 

本发明根据转基因水稻科丰2号品系中插入的目的基因为SCK基因（SEQ ID No.5）通过Hi-TAIL PCR获得外源插入基因5’端水稻侧翼序列和3’端水稻侧翼序列，所获得的含有SCK基因的外源插入载体及其两侧5’ 端和3’端侧翼水稻序列的连接区核苷酸序列为SEQ ID No.1所示；根据科丰2号外源插入载体和3’端水稻侧翼序列所形成的连接区核苷酸序列筛选出了一对特异性强、灵敏度高的转化体特异性引物及探针序列，其核苷酸序列为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3所示；所述探针的核苷酸序列为SEQ ID No.4所示。 

本发明的目的之二是提供一种转基因水稻科丰2号的品系特异性的实时荧光定量PCR检测方法，该方法包括：（1）提取待检测水稻样品的DNA；（2）以提取的DNA为模板，以SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示核苷酸为扩增上下游引物，以SEQ ID No.4所示的核苷酸序列为探针，建立PCR扩增体系并进行PCR扩增；（3）PCR反应结束后，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果； 

其中，在扩增样品的同时，进行SPS内标准基因扩增，在SPS内标准基因扩增时，空白对照无典型扩增曲线，阴性对照和阳性对照出现典型的扩增曲线；在转化体特异性序列扩增时，空白对照和阴性对照无典型扩增曲线，阳性对照出现典型的扩增曲线，表明反应体系工作正常；在反应体系正常的情况下，测试样品出现典型扩增曲线，且Ct值小于等于38，则表明检测出科丰2号转化体成分。 

其中，所述的从待检测水稻样品中提取DNA的方法，可以是从植物材料中提取DNA的各种常用方法，例如可以是CTAB法、异硫氰酸胍法或盐酸胍法等各种方法。 

本发明中所述的PCR扩增体系可参考以下方法建立：反应体系的总体积为20.0μL，其中，2×Mix10.0μL，10.0μmol/L SEQ ID No.2所示上游引物0.8μL，10.0μmol/LSEQ ID No.3所示下游引物0.8μL，10.0μmol/LSEQ ID No.4所示探针0.4μL，25ng/μL DNA模板2.0μL，余量为双蒸水。 

所述的PCR扩增条件优选为：第一阶段95℃/10min；第二阶段95℃/15s，95℃/60s，循环数40；