[发明专利]肺炎支原体耐药诊断试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种PCR检测试剂盒，更具体地说，涉及一种实时定量的肺炎支原体耐药诊断试剂盒。

背景技术

肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae，简称为MP）是儿童、青少年及成人上、下呼吸道感染的常见病原体。23%～50%的学龄前儿童和青少年社区获得性肺炎是由MP感染导致的，流行周期为3～7年。肺炎支原体肺炎易复发或迁延不愈，重症患者常合并肺外症状，对健康危害严重。

MP无细胞壁结构，临床上只能选择抑制或影响其蛋白质和核酸合成的药物，如大环内酯类抗生素、四环素类抗生素、喹诺酮类抗生素等。但由于其他抗生素的不良反应，治疗儿童MP感染首选大环内酯类抗生素。自2001年发现对大环内酯类抗生素耐药的MP以来，MP耐药率逐年升高且流行范围逐渐扩大，已有多个国家或地区分离到MP耐药株。据文献报道，日本2007年MP耐药率已高达40%以上，韩国儿童住院患者MP耐药率为61.3%，意大利为26%，法国为9.8%，德国为3%。中国MP耐药形势则更为严峻，MP临床分离株中92%以上大环内酯类抗生素耐药。MP的耐药机制主要是核糖体大亚基23S rRNA的基因突变和核糖体蛋白L4、L22基因突变，其中23S rRNA结构域V区的2063位点和2064位点的点突变占主导地位。我国发现的耐药MP中2063A-G突变占97%以上。

目前，临床上常用的MP诊断方法为MP培养、血清学检测和PCR。MP培养耗时长，阳性率低，耐药性的监测通常需要体外培养并进行药敏试验，测定最小抑菌浓度（MIC）。血清学检测方法简便易行，但需要患者恢复期血清做对照，急性期诊断效果不佳。常规PCR方法具有快速、阳性率高的优点，但存在假阳性的问题。荧光定量PCR以特异性强、定量准确、重复性好等优点而得到迅速发展，但其并不能判断病原体耐药性，对临床治疗的指导意义有限。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种肺炎支原体耐药诊断试剂盒。该试剂盒可以通过建立荧光定量PCR等位基因鉴别方法，对MP2063位点的基因型进行鉴定，在诊断的同时判断其耐药性。

为实现上述的发明目的，本发明采用下述的技术方案：

一种肺炎支原体耐药诊断试剂盒，包括：

上游引物序列P1：5'TCCAGGTACGGGTGAAGACA'3；

下游引物序列P2：5'GTCCTGATCAATATTAAGCTACAGTAAAGCT'3；

探针序列T1：5'ACGGAAAGACCCC'3，VIC标记；

探针序列T2：5'CGGGAAGACCCC'3，FAM标记。

本发明提供的肺炎支原体耐药诊断试剂盒通过建立荧光定量PCR等位基因鉴别方法，对MP2063位点的基因型进行鉴定，在快速诊断的同时判断其耐药性，从而指导临床实践。该诊断试剂盒的检测灵敏度较好，临床应用前景巨大。

附图说明

图1为MP标准株FH、耐药株307及构建的标准质粒PCR结果。其中，1为MP标准株FH，2为耐药株307，3为敏感2063A质粒，4为耐药2063G质粒，N为阴性对照，P为阳性对照；M为100bp DNA Ladder。

图2为实时荧光定量PCR标准曲线。

图3显示了实时荧光定量PCR鉴定2063等位基因的诊断价值。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

肺炎支原体（MP）是引起儿童肺炎和肺外并发症的一种常见病原体。目前儿童MP感染的主要治疗药物为大环内酯类抗生素。近年来国内、国际临床上越来越多分离到耐大环内酯类抗生素的MP株，主要耐药机制是核糖体大亚基的23S rRNA的编码基因突变。在我国，目前报道97%以上的耐药株为2063A→G突变。自2000年第一次报道实时定量PCR诊断MP以来，已有大量的针对不同扩增序列的实时定量PCR诊断方法研究出现，也出现很多市售试剂盒。但这些方法只能给出阳性或阴性结果，不能获得耐药信息。因此，本发明针对导致MP耐药2063位A→G的点突变，设计引物和探针，建立MP耐药诊断一步法的试剂盒。下面对此展开详细具体的说明。

1材料与方法

1.1标本

1.1.1MP标准株