[发明专利]一种中药材多指标成分含量的快速测定方法

权利要求书

1.一种中药材多指标成分含量的快速测定方法，其特征在于，所述中药材是水蛭或地龙药材，通过以下步骤实现： 

（1）采集水蛭或地龙药材的近红外光谱：将不同产地、不同采收季节的水蛭或地龙药材，置恒温烘箱中除去表面水分，打粉过筛；取适量水蛭或地龙药材粉末置近红外光谱仪的旋转杯中，保持粉末表面平整，采集近红外漫反射光谱，将得到的光谱数据分为校正集和验证集两类；

（2）测定水蛭或地龙药材的多指标成分含量：所述的多指标成分为水分、可溶性固形物、次黄嘌呤、总糖和多糖以及游离氨基酸和多肽；采用烘干法测定水分含量和可溶性固形物含量，高效液相色谱法测定次黄嘌呤含量，高效液相色谱柱前衍生法测定游离氨基酸和多肽含量，碘液-硫代硫酸钠滴定法测定总糖和多糖含量；

（3）建立多指标成分的定量分析模型：将步骤（2）所测定的水蛭或地龙药材的水分含量、可溶性固形物含量、次黄嘌呤含量、总糖和多糖含量以及游离氨基酸和多肽含量分别与步骤（1）水蛭或地龙的近红外光谱数据关联，对于每个指标成分，都对光谱进行不同的预处理并采用不同建模波段，运用偏最小二乘回归方法建立每个指标成分的多个定量分析模型；

（4）确定多指标成分的最佳定量分析模型：最佳定量分析模型通过模型参数确定，模型参数包括相关系数（R）、验证误差均方根（RMSEP）、校正误差均方根（RMSEC）、验证集相对预测误差（RSEP）；若R越接近1，RMSEC与RMSEP越接近，则模型的预测值与标准化学值之间的相关性好，RMSEC、RMSEP、RSEP值越小，则模型的预测精度越高；通过模型参数来评价步骤（3）所建立的每个指标的多个定量分析模型的稳定性和准确性，选择模型参数最佳的近红外定量分析模型来检测未知的水蛭或地龙药材的多指标含量。

2.根据权利要求1所述的一种中药材多指标成分含量的快速测定方法，其特征在于，步骤（1）采集水蛭或地龙药材的近红外光谱使用近红外积分球漫反射采集光谱，以空气为参比，扫描次数为32，分辨率为8 cm^-1，吸光度数据格式为：log1/R，光谱扫描范围为4000～10000 cm^-1。

3.根据权利要求1所述的一种中药材多指标成分含量的快速测定方法，其特征在于，步骤（2）中

（a）水分含量的测定：采用《中国药典》——烘干法测得水蛭和地龙药材的水分含量；

（b）可溶性固形物含量的测定：采用烘干法测定水蛭和地龙药材的可溶性固形物含量；精密移取0.1 g/mL的水蛭或地龙药材浸提液4 mL至已烘干至恒重的扁形瓶（X₀），称重（X₁），置105℃烘箱中，每隔一个小时称重，直至连续两次称重重量差距小于5 mg，最终重量计X₂，可溶性固形物（%）＝（X₂－X₀）／（X₁－X₀）×100%，计算样品的可溶性固形物含量；

（c）次黄嘌呤含量的测定：采用HPLC测定水蛭和地龙药材的次黄嘌呤含量；

取适量0.1 g/mL的水蛭或地龙药材浸提液过0.45μm滤膜，取滤液进样10 μl，按如下色谱条件用高效液相色谱法测定峰面积，通过外标法计算样品的次黄嘌呤含量；

次黄嘌呤HPLC色谱条件：色谱柱Eclipse XDB-C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm,；流动相A：0.01 mol/L磷酸二氢钾溶液；流动相B：50％甲醇；梯度洗脱步骤：0～5 min为100%A相，5～10 min为100%～99%A相，10～50 min为99%～0%A相，后运行10 min；检测波长254 nm；进样量10 μl；柱温25 ℃；流速1 mL/min；

（d）总糖和多糖含量的测定：采用间接碘量法的碘液-硫代硫酸钠滴定法测定水蛭或地龙药材的总糖和单糖，依据硫代硫酸钠的消耗量，先计算碘液的消耗量，再计算样品的总糖和单糖，多糖含量通过总糖含量减去单糖含量而得到；

（e）游离氨基酸和多肽含量的测定：采用HPLC柱前衍生化方法测定水蛭或地龙药材的游离氨基酸和总氨基酸含量，再将总氨基酸含量减去游离氨基酸含量计算多肽含量；

游离氨基酸衍生前供试品溶液的制备：精密称取水蛭或地龙药材粉末一定量，用新制的0.9%氯化钠溶液浸提，得0.1 g/mL浸提液，每1 ml浸提液含0.1 g水蛭或地龙药材粉末，过滤膜备用；

总氨基酸衍生前供试品溶液的制备：将药材粉末浸提液、含1%苯酚的6 mol/L盐酸和40%氢氧化钠按体积比为1:4:2.4混合；具体操作：精密移取药材浸提液和含1%苯酚的6 mol/L盐酸到水解管，混合，充氮气去除氧气，迅速密封，置110℃恒温干燥器内22小时，精密加入一定体积的40%氢氧化钠，涡旋混匀，过膜待用；

流动相A液的配制：配制0.01 mol/L三水合醋酸钠溶液1 L，精密加入三乙胺180 μl，搅拌混匀，滴加2%冰醋酸，调pH＝7.20，加四氢呋喃3 mL，混匀；

流动相B液的配制：配制0.05 mol/L三水合醋酸钠溶液400 mL，滴加2%冰醋酸，调pH＝7.20，与体积比1:1的乙腈-甲醇混合液混匀，得体积比1:2:2的三水合乙酸钠-乙腈-甲醇体系；

硼酸缓冲液：0.2 mol/L硼酸钠溶液用10%氢氧化钠溶液调pH＝10.4；

衍生试剂：①邻苯二甲醛衍生试剂：配制含0.1%巯基丙酸的 4 g/L邻苯二甲醛100 mL，避光并4℃下保存；②芴甲氧羰酰氯衍生试剂：配制1 g/L的芴甲氧羰酰氯50 mL，避光并4℃下保存；

进样前的衍生操作：首先分别精密移取混合氨基酸对照品溶液和四硼酸氢钠0.1 mL和0.5 mL，混匀，再移取0.1 mL OPA衍生试剂，混匀静置一分钟，然后移取0.1 mL 芴甲氧羰酰氯衍生试剂，同样混匀静置一分钟，进样；

采用HPLC测定水蛭或地龙药材的游离氨基酸和总氨基酸含量，色谱条件：色谱柱Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流速1.0 mL/min；进样量10 μl；柱温30 ℃；检测波长：0～46 min为338 nm，46～54.5 min为262 nm，54.5～60 min为338 nm，梯度洗脱步骤：0～4 min为97%A相，4～10 min为97%～92%A相，10～24 min为92%～70%A相，24～30 min为70%A相，30～45 min为70%～40%A相，45～55 min为40%～0%A相，55～60 min为0%～97%A相，后运行10 min；

按上述的色谱条件用高效液相色谱法测定峰面积，通过外标法计算样品的游离氨基酸和总氨基酸含量，多肽含量通过总氨基酸含量减去游离氨基酸含量得到。

4.根据权利要求1所述的一种中药材多指标成分含量的快速测定方法，其特征在于，所述水蛭或地龙药材的游离氨基酸和多肽含量测定的HPLC色谱条件：色谱柱Eclipse XDB-C18柱，4.6 mm×250 mm，5 μm,；A相：0.01 mol/L醋酸钠缓冲液体系；B相：体积比为2:2:1的甲醇-乙腈-醋酸钠缓冲液体系；流速1.0 mL/min；进样量10 μl；柱温30 ℃；检测波长：0～46 min为338 nm，46～54.5 min为262 nm，54.5～60 min为338 nm，梯度洗脱步骤：0～4 min为97%A相，4～10 min为97%～92%A相，10～24 min为92%～70%A相，24～30 min为70%A相，30～45 min为70%～40%A相，45～55 min为40%～0%A相，55～60 min为0%～97%A相，后运行10 min。