[发明专利]单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒及测定方法

权利要求书

1.单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒，其特征在于包括：

（1）全血基因组DNA提取试剂：所述全血基因组DNA提取试剂来源于商品化的血液基因组提取试剂盒，主要成分有缓冲液GD、缓冲液GB、蛋白酶K、吸附柱CB3、漂洗液PW和洗脱缓冲液TB；

（2）多重PCR扩增引物：所述多重PCR扩增引物包括：

PCR引物1（Seq NO1）：

ALDH2Glu504Lys（rs671）上游引物5’-CAGTCACCCTTTGGTGGCTACA-3’；

PCR引物2（Seq NO2）：

ALDH2Glu504Lys（rs671）下游引物5’-CCAGCAGGTCCCACACTCAC-3’；

PCR引物3（Seq NO3）：

MTHFR C677T（rs1801133）上游引物5’-GGCTGACCTGAAGCACTTGAA-3’；

PCR引物4（Seq NO4）：

MTHFR C677T（rs1801133）下游引物5’-CAAGTGATGCCCATGTCGGT-3’；

其中引物1和引物3的5’端均进行生物素标记；

（3）多重PCR扩增反应试剂：所述多重PCR扩增反应试剂名为“2X PyroMark PCR Master Mix”，具体成分包括热启动TaqDNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、镁离子Mg²⁺、钠离子Na⁺以及扩增反应特异性增强剂Q-Solution；

（4）单链DNA分离和纯化试剂：所述单链DNA分离和纯化试剂，包括链霉亲和素琼脂糖、PyroMark结合缓冲液、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液10X浓缩液；

（5）焦磷酸测序引物：所述焦磷酸测序引物包括：

测序引物1（Seq NO5）：

ALDH2Glu504Lys（rs671）测序引物5’-CACACTCACAGTTTTCACTT-3’；

测序引物2（Seq NO6）：

MTHFR C677T（rs1801133）测序引物5’-TGCGTGATGATGAAAT-3’；

（6）焦磷酸测序试剂：所述焦磷酸测序试剂为DNA焦磷酸测序的常规试剂，包括PyroMark退火缓冲液、酶复合物、底物复合物和脱氧核糖核苷三磷酸复合物dNTP，其中dATP为人工修饰的α-硫代脱氧腺苷三磷酸，其余脱氧胞苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胸苷三磷酸未修饰；所述酶复合物包括焦磷酸测序所有需要的酶，即DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶；所述底物复合物为腺苷-5’-磷酸硫酸酐；

（7）盒体：全血基因组DNA提取试剂、多重PCR扩增引物、多重PCR扩增反应试剂、单链DNA分离和纯化试剂、焦磷酸测序引物、焦磷酸测序试剂设在盒体内。

2.单管联合测定乙醛脱氢酶2与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的方法，其特征在于采用如权利要求1所述单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点的试剂盒，包括如下步骤：

（1）人类全血基因组DNA提取：采用所述单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点试剂盒的全血基因组DNA提取部分试剂，包括利用缓冲液GB和蛋白酶K溶解外周血白细胞，缓冲液GD和漂洗液PW去除蛋白成分，最后以洗脱液TB洗脱得到DNA成分，整个提取反应以吸附柱CB3为DNA与细胞碎片和DNA与蛋白质分离的介质；

（2）多重PCR扩增反应：采用所述单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点试剂盒的多重PCR引物和多重PCR扩增反应试剂，具体的反应体系和反应条件如表1和表2所示；

表1多重PCR扩增反应体系

表2多重PCR扩增反应条件

（3）单链DNA样本分离和纯化：采用所述单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点试剂盒的单链DNA分离和纯化试剂，包括在PyroMark结合缓冲液条件下高性能链霉亲和素琼脂糖与带生物素的PCR产物的结合，而分离出单链DNA产物，然后分别经过70%乙醇、PyroMark变性溶液和PyroMark洗脱缓冲液得到纯化的单链DNA样本；

（4）焦磷酸测序与结果分析：采用所述单管联合测定乙醛脱氢酶2基因与亚甲基四氢叶酸还原酶基因突变位点试剂盒的焦磷酸测序引物和焦磷酸测序试剂，具体操作为分别在25μL用PyroMark退火缓冲液稀释至0.3μmol/L的测序引物1和测序引物2中放入已纯化的单链DNA产物，经过80℃持续加热2min后，15～25℃下冷却至少5min，同时在PyroMark Q24试剂仓中加入系统计算所得的酶复合物、底物复合物和四种脱氧核糖核苷三磷酸的各自体积量，然后在PyroMark Q24仪器上运行测序程序，最后测序结束后在PyroMark Q24分析软件运行AQ模式进行结果分析。