[发明专利]H11亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及H11亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测试剂盒。

背景技术

禽流感病毒（Avian Influenza Virus，AIV）属于正粘病毒科A型流感病毒属，根据表面糖蛋白血凝素（Hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（Neuraminidase，NA）的抗原性差异，AIV可进一步分为不同的亚型，目前已鉴别出16种HA亚型（H1～H16）和9种NA(N1～N9)亚型。AIV是一种有囊膜、单股负链、分节段的RNA病毒，基因组分为8个节段，分别编码HA、NA、NP、NS、MP、PA、PB1和PB2蛋白。H11亚型AIV为稀有亚型AIV，对该病的研究相对较少，为了更好地了解H11亚型AIV这个病毒以及构建种毒库，目前，国内外尚未见有该HA亚型AIV的检测方法，因此，建立一种快速、简便和特异的检测方法十分迫切，对该病的诊断具有重要意义。

目前，禽流感病毒常用的检测方法包括病毒鸡胚分离鉴定、普通RT-PCR法、实时荧光定量RT-PCR和酶联免疫吸附法等。病毒鸡胚分离鉴定是检测的金标准，先接种鸡胚增殖病毒，再用血凝试验和血凝抑制试验进行鉴定，该法在实验室的检测最为常见，但耗时太长，常需要两天到一周的时间；普通RT-PCR法和实时荧光定量RT-PCR法快速、灵敏，但仪器相对昂贵，并需技术人员进行操作，不适合在基层推广使用；酶联免疫吸附法快速但需要特殊试剂；这些方法在实际应用上存在一定的局限性。

环介导等温扩增方法（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）最早由日本Notomi等报道，是一种新型核酸扩增技术，与其它方法相比，LAMP具有更方便、更简捷、更灵敏和结果可视化等优点，目前在一些病原微生物的检测中被广泛运用。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测H11亚型禽流感病毒的环介导等温扩增引物组。

本发明所提供的检测H11亚型禽流感病毒的环介导等温扩增引物组，具体为如下引物组A或引物组B：

所述引物组A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6组成；所述引物组B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4组成。

所述引物1（内引物FIP-H11）、所述引物2（内引物BIP-H11）、所述引物3（外引物F3-H11）、所述引物4（外引物B3-H11）、所述引物5（环引物LF-H11）和所述引物6（环引物LB-H11）的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。

所述引物组A中，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的摩尔比具体可为8：8：1：1：4：4；所述引物组B中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4的摩尔比具体可为8：8：1：1。

在本发明的一个实施例中，所述引物1（内引物FIP-H11）和所述引物2（内引物BIP-H11）在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为1.6μM，所述引物3（外引物F3-H11）和所述引物4（外引物B3-H11）在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为0.2μM，、所述引物5（环引物LF-H11）和所述引物6（环引物LB-H11）在环介导等温扩增反应体系中的终浓度均为0.8μM。

序列1由42个核苷酸组成，序列2由41个核苷酸组成，序列3由20个核苷酸组成，序列4由22个核苷酸组成，序列5由20个核苷酸组成，序列6由19个核苷酸组成。

本发明的第二个目的是提供一种检测H11亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂。

本发明所提供的检测H11亚型禽流感病毒的逆转录环介导等温扩增试剂，包括链置换型DNA聚合酶、甜菜碱、dNTPs、Mg²⁺（如MgSO₄）、反转录酶和如上所述的引物组。

当所述引物组为所述引物组A时，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg²⁺、所述链置换型DNA聚合酶、所述反转录酶和所述甜菜碱在所述扩增试剂中的配比为40pmol：40pmol：5pmol：5pmol：20pmol：20pmol：35nmol：125nmol：8U：5U：20μmol。