[发明专利]一种用酿酒酵母工程菌联合降解植物的木质素的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及构建和应用微生物工程菌的方法。具体是应用微生物工程菌降解植物原料的木质素的方法。

背景技术

锰过氧化物酶(Manganese Peroxidase，MnP)、木质素过氧化物酶(Lignin Peroxidase，LiP)和漆酶(Laccase)具有共同降解木质素的作用。

植物资源不断再生，十分丰富。植物的基本成分是纤维素、半纤维素和木质素。其中在制造沼气和乙醇业中有用的成分是纤维素，次之是半纤维素。前者由葡萄糖构成，而后者由戊糖构成。这些糖都是转化为乙醇和沼气的物质。但是纤维素分子之间被木质素镶嵌，被镶嵌着的纤维素不能被水解。木质素是广泛存在于植物体中的无定形的、分子结构中含有氧代苯丙醇或其衍生物结构单元的芳香性高聚物，形成纤维支架，结构十分稳定。欲利用纤维素则必须先降解木质素。当前用于降解木质素的方法有物理、化学和生物的方法。物理法主要是机械粉碎法、高温热解预处理以及辐射预处理等，但是物理法耗能大，并且需要特殊设备；化学法主要是酸或碱处理的方法。化学处理法具有工艺简单的特点，但是处理后的纤维素和半纤维素损失大，并且产生大量的酸碱废气物污染环境。与化学法和物理法相比，当前应用的生物法主要是应用天然的表达分泌降解木质素的酶的白腐真菌与植物原料作用而降解植物原料中的木质素。应用白腐真菌降解植物的木质素的优势在于，白腐真菌具有完整的降解木质素的酶系(锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶)，其不足之处是白腐真菌所含的锰过氧化物酶基因、木质素过氧化物酶基因和漆酶基因只是单拷贝，表达的酶的产量少，并且，白腐真菌生长缓慢，降解木质素的周期长。

酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)是常用于生产重组蛋白的微生物。酿酒酵母营养要求低，能将表达的蛋白分泌到胞外，并且它具有组成型强启动子：三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(pGAP)。

发明内容

本发明构建含锰过氧化物酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌和含漆酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌；用含锰过氧化物酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌和含漆酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌与植物原料作用，通过工程菌分泌锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶而降解植物原料的木质素。

本发明所采用的技术方案是：

1.克隆基因：用反转录PCR技术或PCR技术从含锰过氧化物酶基因的微生物、含木质素过氧化物酶的微生物和含漆酶基因的微生物中分别克隆锰过氧化物酶、木质素过氧化物酶和漆酶基因。

2.通过PCR扩增或DNA序列合成获得构建表达载体所需的启动子、信号肽、转录终止子和抗性基因表达框架的DNA序列。

3.分别构建含锰过氧化物酶基因表达框架(酿酒酵母的磷酸甘油醛脱氢酶启动子的DNA序列-信号肽的DNA序列-锰过氧化物酶基因的DNA序列-转录终止子的DNA序列)的酿酒酵母表达载体、含木质素过氧化物酶基因表达框架(酿酒酵母的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的DNA序列-信号肽的DNA序列-木质素过氧化物酶基因的DNA序列-转录终止子的DNA序列)的酿酒酵母表达载体和含漆酶基因表达框架(酿酒酵母的磷酸甘油醛脱氢酶启动子的DNA序列-信号肽的DNA序列-漆酶基因的DNA序列-转录终止子的DNA序列)的酿酒酵母表达载体。以上所构建的表达载体除了含有基因表达框架之外，还有大肠杆菌复制起点、G418基因表达框架和氨苄青霉素基因表达框架。

3.通过电转化方法将以上构建的3种酿酒酵母表达载体分别转化酿酒酵母。根据G418抗性，筛选高拷贝重组了锰过氧化物酶基因表达框架的酿酒酵母重组子作为含锰过氧化物酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌；筛选高拷贝重组了含木质素过氧化物酶基因表达框架的酿酒酵母重组子作为含木质素过氧化物酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌；筛选高拷贝重组了漆酶基因表达框架的酿酒酵母重组子作为含漆酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌。

4.将以上构建的含锰过氧化物酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌、含木质素过氧化物酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌和含漆酶基因表达框架的酿酒酵母工程菌进行混合而作为降解植物的木质素的酿酒酵母工程菌的混合菌。