[发明专利]噬菌体展示文库及其应用和制备方法

说明书

本发明提供一种噬菌体展示文库及其应用和制备方法。所述噬菌体展示文库包含一系列各自独立地具有三维结构的抗体性多肽，所述多肽中的每一者均包含具有抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域的重链、以及具有抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域的轻链，其特征在于：所述抗体性重链CDR1、CDR2和CDR3结构域以及所述抗体性轻链CDR1、CDR2和CDR3结构域都具有强随机突变性位点，所述强随机突变性位点是位于所述多肽三维结构表面上的用于结合靶抗原的且非保守性的位点，所述强随机突变性位点是由强随机突变简并密码子编码的氨基酸，并且所述强随机突变简并密码子不包括终止密码子。本发明的噬菌体展示文库同时具有多样性和筛选高效性。

技术领域

本发明涉及基因工程及分子生物学领域。具体而言，本发明涉及一种噬菌体展示文库、该文库在筛选特异性识别靶抗原的抗体中的用途以及制备该文库的方法；本发明还涉及编码该噬菌体展示文库所展示的多肽的DNA组合物、用于构建所述噬菌体展示文库的噬菌体质粒组合物、含有该噬菌体质粒组合物的宿主细胞库、用于构建所述噬菌体展示文库的引物及其用途以及包括所述噬菌体展示文库的试剂盒。

背景技术

噬菌体展示技术是将外源蛋白或多肽的DNA序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。噬菌体属于单链DNA病毒，包括F1、fd和M13三类。噬菌体DNA能够在细菌内滚环复制，细菌不被裂解，但生长速度减慢，同时可分泌出大量成熟的噬菌体颗粒。噬菌体的单链DNA长约7000bp，不同类型的噬菌体的一级结构极为相似，基因组编码11种蛋白质，其中5种为结构蛋白，与噬菌体展示密切相关的是二种不同的结构蛋白pⅢ和pⅧ。噬菌体单链DNA被包裹在由大约2700-3000个主要衣壳蛋白pⅧ组成的管状结构中。另外，次要衣壳蛋白pⅢ通过与大肠杆菌的F菌毛结合而引起感染，其是噬菌体感染宿主所必需的。

噬菌体展示平台已经发展成熟，其通过将目标蛋白融合在pIII蛋白基因中的适当位置，从而在噬菌体表面展示目标蛋白(参见文献“Bass,S.,Proteins,8:309(1990);Lowman and Wells,Methods:A Companion to Methods in Enzymology,3:205(1991)”)。由于融合有目标基因的pIII蛋白基因处于低表达状态且野生型pIII蛋白仍在表达，因此能够很好地维持噬菌体的感染性。与此相关的专利文献如：美国专利No.5,723,286、美国专利No.5,432,018、美国专利No.5,580,717、美国专利No.5,427,908和美国专利No.5,498,530。

利用噬菌体文库筛选针对靶蛋白、多肽或小分子的多肽或蛋白的技术已被广泛研究（参见文献“Tonikian,R.,Nature protocols,2:1368(2007)”）。其基本思路为：将设计好的噬菌体文库与固相上的靶蛋白分子经过一定时间孵育后，洗去未结合的游离噬菌体，然后以竞争受体或酸洗脱下与靶分子结合吸附的噬菌体，用洗脱的噬菌体感染宿主细胞，之后繁殖扩增，进行下一轮孵育洗脱，经过3轮～5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异结合的噬菌体得到高度富集。通过噬菌体ELISA，可从富集噬菌体输出文库中挑选出来具有期望结合特性的单克隆噬菌体。

噬菌体展示技术可以产生包含10¹⁰种以上不同展示蛋白的文库，这与人体所能产生的抗体总数相近，从而使基于此技术的抗体筛选成为可能。然而，由于抗体的互补决定区全部可随机产生10⁷⁰种以上的变化，因此，科学地设计抗体的噬菌体展示文库将是决定筛选成功率和效率的关键因素。在这方面，已经有很多研究成果（例如，参见文献“TomLinson,Nature Biotech.(2000),18:989-994”、“Barbas,PNAS9113809(1994)”、“Yelton,D E,J.Immunology,15511994(1995)”、“Jackson,J.R.,J.Immunology,15413310(1995)”和“Hawkins,R E,J.Mol.Biology,2261889(1992)”)。