[发明专利]利用DNA免疫共沉淀分离和鉴定DNA结合蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分离鉴定DNA结合蛋白的方法，具体涉及利用DNA免疫共沉淀技术分离鉴定DNA结合蛋白的方法。

背景技术

生物医学研究已从一个基因一个蛋白的假说演绎到在组学水平分析众多基因或蛋白的功能。由于细胞的各种生命活动现象纷繁复杂，全基因组的序列信息并不能诠释细胞的生物功能，而基因的终极产物蛋白才是细胞构成及功能的最终执行者。在细胞生命的过程中，特异基因的开启和关闭是一个复杂的系统工程，人类基因的转录调控一直以来都是生物学家研究的热点领域。目前，主要利用染色质免疫沉淀技术（ChIP）研究已知蛋白转录因子与DNA相互作用，在基因转录调控中，转录因子及转录调节因子与染色质DNA即启动子区之间存在相互作用，染色质免疫共沉淀技术不仅解决了已知转录因子与启动子DNA直接和间接的相互作用，而且还可以利用实时定量PCR测定转录因子与DNA结合的丰度，筛选出转录因子所结合的特异的启动子序列。

当前，科学家利用大规模的蛋白质组学技术发展并绘制了广泛的细胞内蛋白质之间相互作用的网络图谱。迄今已发展了多种研究蛋白质相互作用的技术方法，包括酵母双杂交系统、噬菌体展示技术、GSTpμll-down技术、免疫共沉淀技术和串联亲和纯化联合质谱分析技术，为蛋白质相互作用及蛋白质组学的研究奠定了坚实的基础。但目前尚缺少利用已知DNA序列分离特异结合细胞核蛋白并进一步鉴定DNA结合蛋白的方法。

发明内容

本发明的发明人经过大量实验和反复摸索，提供了一种利用DNA免疫共沉淀技术分离和/或鉴定DNA结合蛋白的方法以及所述方法的用途，具体包括以下几个方面：

本发明第一方面涉及一种分离DNA结合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：

1）提取细胞的核蛋白；

2）将目标DNA分子与核蛋白混合，孵育；

3）加入能够与该目标DNA分子结合的分子实体，分离得到与目标DNA分子结合的核蛋白组分；

4）对步骤3）得到的核蛋白组分进行进一步分离，得到DNA结合蛋白；

优选地，所述目标DNA分子连接有可检测的标记。

在本发明中，所述细胞为真核细胞；所述真核细胞例如可以为哺乳动物细胞；其中所述哺乳动物例如为人、小鼠、大鼠、狗、猪、羊、猴等。

在本发明中，所述提取细胞核蛋白的方法为本领域所公知。在本发明的实施方案中，所述提取核蛋白的方法包括，采用匀浆器裂解细胞，分离细胞核组分,将核组分经过蔗糖密度梯度离心，纯化细胞核组分，并进一步用含有蛋白抑制剂的高盐裂解液制备细胞核蛋白，然后降低盐离子浓度，去除核组分的DNA成分。

根据本发明第一方面任一项的方法，其中在步骤1）后还包括去除核蛋白中无关高丰度蛋白的步骤。

在本发明中，所述无关高丰度蛋白主要包括组蛋白。

根据本发明第一方面任一项的方法，其中所述去除核蛋白中无关高丰度蛋白的步骤包括：将非特异DNA分子与核蛋白混合，孵育，加入能够与该非特异DNA分子结合的分子实体，去除能够与该非特异DNA分子结合的核蛋白；

优选地，所述非特异DNA分子能够与无关高丰度蛋白结合。

根据本发明第一方面任一项的方法，其中所述DNA结合蛋白是指转录因子或者转录活化因子。

根据本发明第一方面任一项的方法，其中所述能够与该DNA分子结合的分子实体为能够与该标记特异性DNA结合的分子实体；和所述分子实体还偶联有易分离的物质，例如磁珠。

在本发明中，所述可检测的标记为本领域所公知。在本发明的实施方案中，其中所述可检测的标记为生物素，其中所述能够与该标记的DNA分子结合的分子实体为亲和素，例如链霉亲和素。

根据本发明第一方面任一项的方法，其中步骤4）中所述分离得到与目标DNA分子结合的核蛋白组分，包括对结合的核蛋白组分进行洗脱的步骤。

在本发明中，可以根据不同的标记分子选择洗脱液。

在本发明的实施方案中，所述洗脱液可以将结合在DNA分子上的蛋白复合体洗下，而分子实体与易分离的物质保持结合。

根据本发明第一方面任一项的方法，其中步骤4）中所述分离的方法为分离蛋白的方法，例如为电泳，例如为蛋白质电泳，例如为聚丙烯酰胺凝胶电泳。

在本发明的实施方案中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳可以为SDS-PAGE，脉冲场凝胶电泳（PFGE），双向电泳等。

在本发明的实施方案中，所述聚丙烯酰胺凝胶电泳为十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。