[发明专利]基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及microRNA，具体涉及一种基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆microRNA检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核细胞中的长约22个核苷酸的非编码RNA分子，参与了在生物体中许多生理病理过程,通过调节基因表达,在细胞增殖、凋亡、生长发育、细胞分化、代谢等过程中发挥重要作用。具体表现为miRNA在细胞核内经过形成最初的初级转录本pri-miRNA到pre-miRNA，后转运出细胞核，通过剪切形成成熟miRNA，通过与Ago蛋白等形成RISC（RNA诱导的沉默复合体），部分抑制或降解靶mRNA序列，参与基因表达调控（Bartel DP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J].Cell,2004,116(2):281-297.）。

由于miRNA在肿瘤的发生、发展、预后判断以及许多其他疾病状态下扮演着重要角色，精确检测其表达情况对于研究miRNA的作用具有重大意义，目前检测miRNA的方法主要有northern blot技术、实时荧光定量PCR技术、原位杂交技术、微阵列芯片技术等。其中northern blot技术是RNA检测的早期手段之一，但其特异性和敏感性低，如果样本RNA含量低或存在降解，可能检测不到；原位杂交技术用于检测组织和细胞水平miRNA的分布情况，同时对miRNA进行半定量检测，其不足之处在于不能准确检测到低表达的miRNA；微阵列芯片技术是一种高通量的检测技术，能同时检测一种或多种样本的大量的miRNA，但存在芯片制作费时、费力、标记成本高、检测灵敏度与特异性低等问题。

实时荧光定量技术（RT-qPCR）是目前最普遍用于基因表达检测的技术之一，具有简便快速、敏感性高和特异性好等特点。目前用于检测miRNA的实时荧光定量PCR方法包括RNA逆转录和下游的荧光定量PCR两部分，其中逆转录根据反转录引物的不同分为两种：同聚物加尾法和茎环逆转录法；荧光定量PCR的检测分为染料法和探针法，其中目前检测miRNA的探针多为Taqman-MGB探针（一种适合于扩增短片段的荧光探针）。由于成熟的miRNA具有片段短小的特点，要特异的检测，探针法更有优势，在敏感性和特异性上优于染料法。基于茎环结构的逆转录引物能特异识别，扩增成熟的miRNA序列，而miRNA的前体并未被扩增，Taqman-MGB探针检测miRNA的缺点在于合成价格贵，不利于推广。

目前AllGlo探针已经成功应用于检测疱疹病毒、乙型肝炎病毒基因突变（Feng,Z.L.Yu,X.Y.Lu,Z.M.Geng,D.Y.Zhang,L.Chen,S.J.Rapid detection of the hepatitis B virus YMDD mutant using AllGlo^TMprobes[J].Clin Chim Acta,2011，412(11-12)：1018-1021）、侵袭性曲霉菌病（Wu,D.S.Shen,J.Z.Zhou,X.Q.Shen,S.F.Wu,X.M.The establishment and evaluation of diagnostic accuracy of AllGlo(TM)probe-based techniques for invasive aspergillosis[J].Zhong hua Nei Ke Za Zhi,2010,49(2):142-145）、K-ras基因突变、强直性脊柱炎等检测。

发明内容

针对现有检测血浆miRNA方法中使用的试剂盒和检测方法存在的上述缺陷，本发明的第一个目的在于提供检测三种血浆miRNA的特异引物。

本发明的第二个目在于提供基于AllGlo探针荧光定量PCR的血浆miRNA检测试剂盒。

本发明的第三个目的在于提供一种基于AllGlo探针荧光定量PCR的三种血浆miRNA检测方法。

所述三种血浆miRNA分别是指hsa-miR-504、hsa-miR-133b、cel-miR-39；其中hsa-miR-504与hsa-miR-133b为人源性miRNA，cel-miR-39为线虫来源的miRNA，作为一种外源性参照miRNA，从血浆提取开始加入血浆中，作用在于能够从提取miRNA开始监测整个实时荧光定量PCR的全过程。