[发明专利]一种产庆大霉素A工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明属于抗生素制药领域，涉及一种产庆大霉素A工程菌及其应用。 

背景技术

小单孢菌可产生丰富的次级代谢产物，特别是氨基糖苷类抗生素，如庆大霉素、西索米星和福提米星等。这些小单孢菌分布奇特，生长缓慢且细胞壁结构特殊，故研究进展缓慢。此外，由于缺乏通用的基因操作系统，小单孢菌遗传操作困难，使得对其分子生物学的研究也大大落后于链霉菌。 

庆大霉素(Gentamicin，GM)是由小单孢菌属中的绛红小单孢菌(Micromonospora purpurea)或棘孢小单孢菌（Micromonospora echinospora）等发酵产生的氨基糖苷类广谱抗生素，对多种革兰阴性菌和阳性菌有较强的抗菌作用。1963年，美国人Weinstein首次发现，1969年被用于临床，它是我国乃至世界抗感染必备的基本药物。庆大霉素属多组分代谢产物，临床应用的庆大霉素为庆大霉素C族的混合物，主要为C1、C2、C1a和C2a；此外，作为庆大霉素中间体的A，B和X族等，也有非常重要的作用。庆大霉素A，X具有良好的抗原虫和抗线虫作用，G418常用于分子生物学试验中的抗性筛选，庆大霉素B是进一步合成广谱低毒氨基糖苷类抗生素异帕米星的母体药物。目前氨基糖苷类抗生素已发展到了第三代，随着此类抗生素作用机制研究的不断深入和各种新兴技术的不断运用，各国科学家正通过各种化学改造，以获得广谱、低毒、高效、耐酶或抗耐药菌的新衍生物。近年来，又发现氨基糖苷类抗生素具有抗HIV的功效，有望进一步开发出新型的专一性靶向RNA的类庆大霉素药物。因此对该类稀有药用微生物进行深入研究，特别是分子遗传学方面的研究具有重要科学意义。 

尽管人们对小单孢菌和庆大霉素的研究已超过五十年，也取得了一些可喜的成果，但一直未有重大的突破。青霉素在五十余年的研究开发过程中，效价提高近万倍，而庆大霉素五十年中仅提高几十倍，两者差距悬殊。二十世纪八十年代兴起的链霉菌基因工程，已在抗生素生物合成基因的克隆、产量提高、组分改善及杂合抗生素生产等方面取得了一定的进步，但在小单孢菌中的应用开发进展缓慢。2006年Piepersberg.W等公布了棘孢小单孢菌庆大霉素生物合成基因簇，长达84222bp。2012年潘成奇等公布绛红色小单胞菌庆大霉素生物合成基因簇（44181bp，JQ975418）。严凌斌等于2011年成功建立大肠杆菌-小单孢菌结合转移技术体系，为小单胞菌基因功能研究以及定向改造庆大霉素代谢流奠定了基础。 

当庆大霉素生物合成进入X2到G-418的时候，涉及到两次在非活性C上的甲基转移反应（Scheme 1）。借助计算机分析庆大霉素生物合成基因簇，结果显示：基因gntK产物介导了其中的一个C-甲基化反应。在磷霉素的生物合成中，Fom3是GntK-样蛋白中有代表性的一员，因此提出：Fom3是一种C-甲基转移酶，其底物为S-腺苷甲硫氨酸衍生的5^/-去氧腺苷基，并以甲基钴胺素作为催化剂，催化非活性C上的C-H键，使该键发生均裂，Fom3同时也是甲基的一个来源。提出这种新型的甲基转移机制是受Fom3结构域的构成所启发（也就是，一个钴胺素结合结构域和一个以Cys-XXX-Cys-XX-Cys基序为特征的S-腺苷甲硫氨酸基结构域），这种结构域的形式在Gntk中也存在。Gntk也和Fms7有高度同源性(Fok7在基因库的登记号为AJ628421)，能在福提霉素KL1的C-6^/位上加上一个甲基。庆大霉素和福提霉素化学上的一个共同点是C-6^/位上的甲基化，而存在这种共同的化学作用支持了GntK催化C-6^/位上的甲基化反应这个观点。尽管GntE序列与GntK序列的同源相似性极其有限，但GntE结构域的构成同样与GntK类似。目前的研究表明：gntE的失活导致庆大霉素A2的积累，这表明gntE参与庆大霉素A2到A的转变。此外，庆大霉素高产菌株被成功设计为积累庆大霉素A2。