[发明专利]日本短体线虫的PCR检测试剂及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及短体属线虫的检测技术，具体涉及日本短体线虫的PCR检测试剂及试剂盒。

背景技术

短体属线虫（Pratylenchus Filipjev，1936）为植物根系专性内寄生线虫，是植物病原线虫中种类最多、分布最广、为害最严重的类群之一，具有十分重要的经济意义。我国于2007年将短体线虫（非中国种）列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》，在口岸实施严格检疫，以保护我国农业和生态安全。日本短体线虫Pratylenchus japonicus Ryss,1988为宁波口岸首次从来自日本的鸡爪槭中截获。国内尚无分布，为非中国种，是我国进境植物检疫性有害生物。日本短体线虫在1963年首次由日本的Gotoh和Ohshima提到，当时只鉴定到短体属，1974年Gotoh又将这个种归于穿孔属，1982年Minagawa将该种鉴定为大针短体线虫Pratylenchus macrostylus Wu,1971。1988年，俄罗斯学者Ryss将在日本发现的该种线虫与加拿大发现的大针短体线虫进行区分，把它描述为新的亚种P.macrostylus japonicus,Ryss,1988。直到1997年，日本的Mizukubo等根据形态学特征、测计值及分子生物学特征，将其与大针短体线虫区分开来，并将其从亚种提升到种，命名为日本短体线虫。日本短体线虫仅发现于日本，我国尚未有相关报道。其寄主包括栎属的扁果麻栎、槲树、枹栎以及苹果、枇杷、矮樱桃等几种果树，可以对寄主造成侵染，影响寄主植物的生长。

我国口岸出入境检疫实验室或其他相关部门，都面临着对短体线虫进行快速、准确的鉴定这一难题。近年来，虽然在形态学鉴定的基础上，PCR－RFLP、荧光PCR、特异性PCR、序列测定、LAMP技术等已在线虫鉴定上广泛应用，但在短体线虫上应用很少。目前还未公开日本短体线虫的分子生物学方面的检测报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、特异、准确的日本短体线虫的PCR检测试剂及试剂盒。

本发明系选择参考GenBank中日本短体线虫的核糖体28S基因（Internal Transcribed Spacer），使用Primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp）设计了特异性引物，经过大量的反应条件优选、对比试验和验证试验，并经过大量实际样品的检测应用评估（以日本短体线虫的DNA为模板，穿刺短体线虫、咖啡短体线虫、伤残短体线虫、卢斯短体线虫为阴性对照，水为空白对照，利用引物进行PCR检测。通过观察扩增产物的保守性和特异性，筛选最适引物），筛选得到扩增效率和特异性好的一对特异性引物。引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

本发明的日本短体线虫的PCR检测试剂，包括一对特异性引物，所述一对特异性引物的核苷酸序列分别为：

上游引物：5’-GGCAACGGGC CTAGTTATGA-3’

下游引物：5’-GACTCGCGCA CACGATAAAC-3’。

日本短体线虫的PCR检测试剂盒，由无Mg²⁺的10×PCR缓冲液，浓度为25mM的MgCl₂溶液，浓度为0.1mM的dNTP溶液，浓度5U/μL的Taq酶溶液，浓度都为10μM的上游引物溶液和下游引物溶液组成。

与现有技术相比，本发明的优点是日本短体线虫的PCR检测试剂及试剂盒，包括一对特异性引物，上游引物的核苷酸序列：GGCAACGGGC CTAGTTATGA，下游引物的核苷酸序列：GACTCGCGCA CACGATAAAC。该特异性引物对日本短体线虫特异、灵敏，扩增的特异性片段大小为176b_p，对其它短体线虫无特异性条带片段；应用本发明的特异性引物及试剂盒，可在4小时内完成检测，灵敏度高，实用性强。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1、日本短体线虫的PCR检测试剂盒