[发明专利]薄皮甜瓜中果肉蛋白质组分析方法

说明书

技术领域

本发明属于园艺作物蛋白质组分析领域，尤其涉及一种薄皮甜瓜中果肉蛋白质组分析方法。

背景技术

甜瓜（Cucumis melo.L）果实香甜，富含糖、淀粉，还有少量蛋白质、矿物质及其他维生素，作为一个优质高产的园艺作物，近年来越来越受到青睐。然而，目前关于甜瓜生长发育进程中蛋白质组的变化、不同生境下的差异蛋白质组以及外源物质调节的蛋白质组变化鲜见报道。特别是果实中蛋白质的含量和各种酶对果实发育过程中不同生理生化反应的作用，逆境条件下果实中蛋白质种类、功能及代谢的途径，以及蛋白质磷酸化的作用机制等等方面的研究缺乏。这些都与实际生产存在密切关系，因此，研究甜瓜果实中的蛋白质组，并结合代谢组的研究探索果实发育模式及制定相应调控措施，将为创造高产、具有良好农艺特征的甜瓜提供美好的前景。

发明内容

本发明提供了一种薄皮甜瓜中果肉蛋白质组分析方法，应用本发明的方法可以从薄皮甜瓜中果肉提取出较高纯度的蛋白质，得到清晰、重复性好的图谱，并且经过数据的分析能得出较多差异蛋白点，便于质谱分析。

    本发明提供的一种薄皮甜瓜中果肉蛋白质组分析方法，是将薄皮甜瓜中果肉总蛋白质提取后，首先进行等电聚焦电泳，再进行SDS-PAGE凝胶垂直电泳。

优选地，所述薄皮甜瓜蛋白质提取是将薄皮甜瓜中果肉用Tris提取液/Tris-饱和酚提取，用含乙酸铵的甲醇溶液沉淀得到的。

此方法可以有效提取薄皮甜瓜中果肉的蛋白质，避免大量糖分和其他有机质的影响。

进一步地，每1g薄皮甜瓜中果肉需要3~4 ml Tris提取液和3~4 ml Tris-饱和酚。

在此比例下可以最大量的溶解出样品中的蛋白质，减少样品和试剂的浪费。是提取甜瓜中果肉总蛋白的最优比例。

    所述Tris提取液和Tris-饱和酚的体积比为1：1。

优选地，所述等电聚焦电泳中使用24cm胶条。

选择24cm胶条，是为了使蛋白质更好的分离，避免蛋白质点之间的重叠，使蛋白质点在胶上达到最大程度的分离。

进一步地，所述等电聚焦电泳中上样量为800μg蛋白质，终上样体积为450μl。

此上样量是24cm胶条的最优上样量，这样蛋白点聚焦好，无横纹和竖纹，分离彻底，能够得到清晰的蛋白质图谱。

优选地，所述等电聚焦电泳后包括胶条平衡的步骤，所述胶条平衡分两步，每步20min。

每步平衡20min，可以保证每步的平衡完全彻底，又不会造成过度平衡。

优选地，在所述SDS-PAGE凝胶垂直电泳中，先1W /块跑1h，琼脂糖形成一条直线后，调成5W/块跑8h。

前1h以内选择1W/块胶的功率跑胶，可以使蛋白质在低功率下均匀平稳的从胶条上转移到胶上，然后选择较高的功率跑胶，使不同的蛋白质达到快速高效的分离。

优选地，所述SDS-PAGE凝胶垂直电泳后包括固定、染色、脱色的步骤，在固定后用纯水清洗，所述染色时间为24小时。

本发明提供了一种经济、简便、易行、快速的适用于薄皮甜瓜中果肉的总蛋白的提取及双向电泳方法。本发明使用Tris/酚提取-甲醇乙酸铵沉淀法提取蛋白质，可以有效提取薄皮甜瓜中果肉的蛋白质，减少大量糖分和其他有机质的影响。目前，经反复实验证明：实验样品制备全、2-DE电泳操作简单、且图谱清晰、重复性好、试剂毒性较低、结果可靠，可为葫芦科园艺作物蛋白质组学研究提供技术范例，是一套适用于薄皮甜瓜中果肉蛋白质组分析的双向电泳技术。

附图说明

图1为上样量为500μg蛋白质，使用不同pH范围的胶条进行等电聚焦电泳，再进行凝胶垂直电泳后的图谱比较；其中，图1A使用的是pH3-10，24cm胶条；图1B使用的是pH4-7，24cm胶条；

图2为使用pH4-7，24cm胶条时，不同蛋白质上样量进行等电聚焦电泳，再进行凝胶垂直电泳后的图谱比较；其中，图2A的上样量为500μg蛋白质；图2B的上样量为800μg蛋白质。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。如未特殊说明，“%”为质量百分比。

薄皮甜瓜虽然包括许多品种，但是品种间果实中糖类、胶质、酚类等物质的成分和含量相差不多，因此本发明的方法适用于薄皮甜瓜的所有品种。