[发明专利]用于制备昆虫神经元细胞的生理缓冲液、消解液及方法

说明书

技术领域

本发明涉及用于制备昆虫神经元细胞的生理缓冲液、消解液及方法。

背景技术

昆虫的神经系统由外胚层的一部分细胞特化而成，属于腹神经索型，联系着体壁表面和体内的感觉器和反应器，昆虫通过神经系统与外界环境取得联系，协调虫体的快速运动。昆虫神经元细胞的分离和体外培养，不仅为细胞学研究提供了极好的神经细胞研究平台，而且在开发以昆虫神经系统为靶标的杀虫剂过程中具有重要作用。目前国内外急性分离蜚蠊目、鳞翅目等昆虫神经元细胞，主要通过以下4个方法进行。

（1）解剖并获得美洲大蠊（Periplaneta americana）腹神经索神经节背侧不成对中间神经元（DUM neurons）的末端神经节（TAG），在生理溶液①中漂洗后，于室温（20-25℃）条件下置于消化酶溶液②中酶解5min，然后用消化终止液③来终止酶解作用，并悬浮细胞，即用于电生理实验。（王瑞兰，梁宋平.虎纹捕鸟蛛毒素虎纹毒素—III对美洲蜚蠊神经细胞电压门控离子通道的影响.昆虫学报2009,52(2):126-132）

①生理溶液（mmol/l）：氯化钠200，氯化钾3.1，氯化镁4，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，蔗糖50，pH7.4。

②消化酶溶液(mmol/l)：氯化钠200，氯化钾3.1，氯化镁4，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，蔗糖50，胰蛋白酶0.3%，胶原蛋白酶IV0.5%，pH7.4。

③消化终止液（mmol/l）：氯化钠200，氯化钾3.1，氯化镁4，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，蔗糖50，胎牛血清5%，青霉素50IU/ml，链霉素50μg/ml，pH6.8。

（2）解剖并获得美洲大蠊（Periplaneta americana）中枢神经神经索末端腹神经节（TAG），置于生理溶液①中漂洗2次，转移入消化酶溶液②中，无菌条件下37℃水浴消化35min。酶解后，弃消化液，用消化终止液③冲洗终止消化，并反复轻柔吹打，以彻底分散神经节中的细胞。细胞悬浮于消化终止液中。（许鹏，孙芹，陈超，程洁，高蓉，姜志宽，肖杭.美洲大蠊中枢DUM神经元的分离和电压门控Na+电流的记录.昆虫学报2009,52(4):380-385）

①生理溶液（mmol/l）：氯化钠200，氯化钾3.1，氯化钙5，氯化镁4，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，蔗糖50，pH7.4。

②消化酶溶液（mmol/l）：氯化钠200，氯化钾3.1，氯化钙5，氯化镁4，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，蔗糖50，IV型胶原蛋白酶1.5mg/ml。

③消化终止液（mmol/l）：氯化钠200，氯化钾3.1，氯化钙5，氯化镁4，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，蔗糖50，胎牛血清(5%,v/v)、1%双抗（青霉素50IU/ml，链霉素50mg/ml）。

（3）解剖并获得棉铃虫（Helicoverpa armigera）幼虫腹神经索，用生理溶液①漂洗2次，在消化酶溶液②中孵育5～10min后去除神经鞘，继续振动消化25～35min。然后用消化终止液③终止酶作用，将细胞分散悬浮于培养基中。（贺秉军，刘安西，陈家童，孙金生，芮昌辉，孟香清.棉铃虫幼虫神经细胞的急性分离培养及其电压门控通道的膜片钳研究.昆虫学报2001,44(4):422-427）

①生理溶液（mmol/l）：氯化钠90，氯化钾6，氯化钙2，氯化镁2，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，葡萄糖140，pH6.6。

②消化酶溶液（mmol/l）：氯化钠90，氯化钾6，4-羟乙基哌嗪乙磺酸10，葡萄糖25，D-甘露醇115，胰蛋白酶0.3%，Ⅳ型胶原酶0.15％，pH6.6。

③消化终止液：为细胞培养基，具体成分为Tc-100(Gibico)，L-15(sigma)，Grace(Gibico)，DMEM(Gibico)，或Tc-l00分别与L-15、Grace和DMEM按4:1、3:1、2:l或1:1的混合。并增补10%胎牛血清，100mmol/l葡萄糖，0.6mmol/l谷氨酰胺，0.3mg/ml谷胱苷肽，80U/ml庆大霉素，pH6.6。