[发明专利]一种短小芽孢杆菌及其在制备胞外多糖中的应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物筛选应用技术领域，具体涉及一种短小芽孢杆菌及其在制备胞外多糖中的应用，该短小芽孢杆菌所生产的胞外多糖用于对虾WSSV的预防与治疗。

背景技术

对虾养殖大面积发展兴起于七、八十年代，我国沿海从南到北对虾养殖产量很大，对沿海经济的发展起到了很大的促进作用。目前，病毒感染是影响对虾养殖的严重威胁，给对虾养殖户造成严重的经济损失。对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus，WSSV)病是当前严重危害对虾养殖业健康发展病毒性疾病之一。根据世界银行的虾病报告，1994年对虾病毒病对全球对虾养殖业造成74％的产量损失，其经济损失达30亿美元以上。1995年，国际兽疫局(OIE)、联合国粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)将该病列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一。

对虾白斑综合征病毒(WSSV)病，于1992年首次发现于台湾，1993年5～8月在我国大陆沿海从南到北的养殖场暴发，日本等亚洲国家的对虾养殖场也相继暴发了此病。目前，在亚洲已报道的该病毒的流行国家和地区包括朝鲜、泰国、韩国、印度尼西亚、越南、马来西亚、印度、斯里兰卡、孟加拉国、中国大陆沿海及台湾省等。1995年，美国德克萨斯州对虾养殖场出现白斑综合征病毒，并在西半球的其它地区相继暴发。至此，WSSV在世界范围内传播开来，每年给对虾养殖业造成几百亿元美元的经济损失，成为威胁对虾养殖业的主要疾病之一。

抗生素的发现促进了人类医学的巨大进步，抗生素也是动物养殖业尤其是水产养殖业抗菌治病的首选药物。但随着高密度、集约化、规模化、工厂化养殖模式的迅速发展，病害大量传播、抗生素肆意滥用、养殖环境恶化、病原耐药性增强、养殖动物药物残留等问题也日益为人们所关注。开拓符合环境友好型的病害防治产品已经成为水产养殖业的迫切需求。益生菌作为抗生素的替代品，对养殖产品无毒副作用、无残留和抗药性，提高了水产动物生产性能和健康水平，保证水产品质量及促进水产养殖业的可持续发展，能够获得较好的社会效益和经济效益。

发明内容

本发明的目的是提供一种短小芽孢杆菌及其在制备胞外多糖中的应用，该短小芽孢杆菌生产的抗病毒胞外多糖产品可以提高对虾对抗WSSV作用的能力，减少对虾死亡率。

本发明提供一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)，为GY001株，保存编号为：CGMCC No.8639，保藏日期2013年12月27日，保藏单位为中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

本发明所筛选的短小芽孢杆菌用于发酵生产胞外多糖；

其最适发酵温度为37℃。

本发明的短小芽孢杆菌还用作免疫增强剂；可以用于对虾养殖药物的制备，或者用于作为抗病毒药物添加到对虾养殖饲料中。

本发明筛选出胞外多糖短小芽孢杆菌其胞外多糖的抵抗酸碱能力强，其独特的活性结构具有对抗对虾病毒的作用独特功能，具有维护良好的对虾消化道平衡的生态作用。可明显提高养殖对虾非特异性免疫水平，大大增强养殖对虾抗病原菌感染力，特别是可以显著提高对虾抵御病毒感染能力等多种生物学功能，成本低廉，易于运输、储藏。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进一步说明，在实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)GY001菌株的筛选

(1)细菌的分离纯化：

2013年2月从青岛胶南分别提取来自经过WSSV发病的池塘中的抗病南美白对虾肠道样本，放入100ml无菌水中，振荡20min后即为细菌悬浮液。分别吸取1ml，稀释1000倍后，取30μl涂布于LB平板上，略干后倒置30℃培养。48h后，根据平板上的菌落形态、颜色的特征，挑选代表性菌落于LB平板上划线纯化，纯化后的细菌分离物接种于斜面培养基，4℃保存待用。最后从对虾肠道中共分离获得125株菌株。

（2）抑菌筛选

抑菌实验—双层平板，牛津杯法：每5mL灭菌营养琼脂培养基（50℃左右）加100μL致病菌菌液（菌量10⁶数量级），混匀后倾倒至营养琼脂平板做成双层平板，凝固后在培养基上放置牛津杯，向牛津杯中添加200μL培养好的短小芽孢杆菌菌液，待菌液扩散后放入28℃培养箱中培养20h，观察抑菌圈直径；