[发明专利]华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂、试剂盒及其检测方法。 

背景技术

华支睾吸虫（Clonorchis sinensis），又称肝吸虫，成虫寄生于肝的胆管内，可引起华支睾吸虫病（clonorchiasis），又称肝吸虫病。曾在中国、日本、韩国、菲律宾、新加坡和马来西亚、俄罗斯等国有华支睾吸虫感染的报道。近年来，由于食物的多样化和国外饮食习惯的引入，本病在我国的感染率逐步增高，人群感染率从1～30%不等。根据全国首次寄生虫病调查表明，全国感染率平均为0.356%，以此推算，全国大约有470万感染者。其主要原因是食生鱼的习惯所致。据1988年的调查资料表明在黑龙江佳木斯地区的麦穗鱼感染率也为100%；在台湾省日月潭地区，上述两种小鱼华支睾吸虫囊蚴的感染率甚至高达100%。华支睾吸虫囊蚴主要分布在鱼体的各部分，如肌肉、皮、头、鳃、鳍及鳞等，一般以鱼肌肉最多，尤其在鱼体中部的背部和尾部较多。也可因鱼的种属不同，囊蚴的分布亦不同。除淡水鱼外，淡水虾如细足米虾、巨掌沼虾等也可有囊蚴寄生，因此，水产品、特别是淡水鱼中囊蚴的检测已经成为食品 安全的首要问题。 

广州管圆线虫病是一种新发食源性人畜共患传染病。人们由于误食带疫福寿螺、田螺、环棱螺等贝类，导致了本病的频繁暴发。到目前为止仍没有从中间宿主中检测广州管圆线虫的报道。 

传统的华支睾吸虫和广州管圆线虫检测仍停留在人工分离、显微镜检查、专家鉴定等阶段，但检测周期长、且灵敏度极低等缺点不能被广泛应用。 

发明内容

本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种特异性强、灵敏度高、无污染、高通量、可对低含量华支睾吸虫感染宿主和广州管圆线虫感染宿主进行准确检测的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂、华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂盒。 

本发明进一步要解决的问题在于，提供一种快速、特异、敏感、可同时检测大量样品的华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测检测方法。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是： 

一种华支睾吸虫和广州管圆线虫双重实时荧光PCR检测试剂，所述检测试剂包括华支睾吸虫检测组分、广州管圆线虫检测组分和内标序列检测组分； 

其中，华支睾吸虫检测组分是针对以华支睾吸虫ITS1基因的保守片 

段为靶目标的，包括： 

引物：CS-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′CS-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′ 

探针：CS-Pb229：5′-CTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAG-3′； 

所述华支睾吸虫ITS1基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为： 

CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTCTTGCAGCATTGTCTGCCTAGGGCGGAGCGATCCTAGTTCCGTCATGTTCTACATGTATGTTCCGCATGCATGCTG； 

所述广州管圆线虫检测组分包括： 

广州管圆线虫检测组分是针对以广州管圆线虫ITS2基因的保守片段为靶目标的，包括： 

引物：Can-PF：5′-CGCATGATATTAAAAGACGTTGCT-3′ 

      Can-PR：5′-GTAAACGCACAAAACGCACG-3′ 

探针：Can-Pb：5′-CCGCGGCGCATTCGACCAT-3′； 

所述广州管圆线虫ITS2基因的保守片段的扩增目标核苷酸序列为： 

CGCATGATATTAAAAGACGTTGCTGCCGCGGCGCATTCGACCATGGCTTGTCGTCGGCTGTCGAATGGTGGCGTGCGTTTTGTGCGTTTAC； 

所述内标序列检测组分包括： 

IC-PF：5′-CGATTCTAGTTCCGTCATCTGTC-3′ 

IC-PR：5′-CAGCATGCATGCGGAACATA-3′； 

IC-PB：5′-CTCTCTCGCTCGCAACGATCGTCG-3′ 

用于制作假病毒内标的扩增目标核苷酸序列为：