[发明专利]一种进行全血基因组快速扩增的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医学分子分析研究领域中的一种进行全血基因组快速扩增的方法。

背景技术

近年来，应用PCR技术进行人类或动物遗传背景进行分析已经成为重要的技术分析手段。在进行遗传背景分析过程中，主要的样本材料为血液，由于血液中含有大量的DNA聚合酶抑制物质，如血红素，杂蛋白，脂肪等，因此用PCR方法直接对血液中的核酸进行扩增根本不可能。为了完成血液样本的核酸扩增，必须将核酸物质从血液中纯化出来才能进行。经典的血液核酸提取方法主要包括几个过程。一、通过低渗液涨破红细胞，将血红素物质释放出来，然后离心、清洗去除血红素。二、通过裂解液裂解白细胞，释放核酸物质。三、通过离心柱或纳米磁珠特异性的吸附核酸物质，除去其他杂质。四、通过漂洗液洗掉挂在离心柱或纳米磁珠表面的化学试剂残留和蛋白残留。五、加入洗脱液将核酸从离心柱或纳米磁珠上洗脱下来。在纯化过程中，由于步骤繁多，往往会导致核酸损失在80-90%以上。并且由于操作过于复杂，往往导致样本间出现交叉污染，导致后面PCR扩增分析失败。血液样本如果能够直接作为模板或经过简单处理就能够作为模板进行PCR扩增，这将非常有效的解决上述血液提取面对的难题。

为了解决血液严重抑制PCR扩增的这个难题，一些著名酶制剂公司，开发了一些特殊的酶制剂来解决这个问题，包括美国Thermo Scientific公司开发的Phusion热启动II高保真DNA聚合酶，美国KAPA Biosystems公司开发的KAPA第二代Taq酶，英国NEB公司开发的Hemo KlenTaq酶等等，这些酶制剂能够缓解血红素对PCR反应的抑制效应，从而使PCR扩增能够有效的进行下去。但是这种方法学由于使用了缺陷型的Taq酶，导致了由Taq酶引导的PCR扩增过程保真度较低，常常导致非特异性扩增，从而检测结果出现假阳性。同时，由于使用了这些特种Taq酶，也导致了检测和扩增成本非常高昂，是普通Taq酶扩增价格的20-30倍。这也导致了该方法由于成本过高推广难度非常大。因此，研究开发一种进行全血基因组快速扩增的方法是目前急待解决的新课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种进行全血基因组快速扩增的方法，该发明在核酸释放剂的作用下，核酸能够直接，快速的从血液中白细胞或细小细胞等有核细胞中释放出来，同时，核酸释放试剂又能够导致血红素和其他杂质蛋白变性，减少这些干扰物质对于后续PCR扩增的干扰,从而实现血液基因组快速PCR扩增检测。

本发明的目的是这样实现的：一种进行全血基因组快速扩增的方法，全血基因组快速扩增的方法是通过核酸释放剂及与之相匹配的PCR反应液来实现的，主要步骤为，取5μl核酸释放剂加入到PCR反应管中，然后取5μl血液与之混合，室温静止5-10分钟，然后取40μl配置好的PCR反应液直接加入上述混合液中，最后上机扩增；所述核酸释放剂组成为0.1-0.5M NaOH，5-50mM Chaps，75-750mM(NH4)₂SO₄，0.1-2M甲酰胺；所述PCR反应液组成为30mmol/L Tris-HCl（PH7.5），10mmol/L(NH4)₂SO₄，30mmol/LKCl，4.5mmol/LMgCl₂；所述PCR反应液中添加0.1-0.5M Betaine，0.01-0.1%Gelatin，0.5-5mg/ml BSA，50-500mmol/L海藻糖；所述PCR反应液中dNTPs的组成比例为：dATP:dCTP:dGTP:dTTP=1:1:1:1:1，其使用浓度为200-800μm，优选使用浓度为600μm；所述用于进行试验测试使用的引物序列分别为5'-TCGTATTGGGCGCCTGGTCAC-'3（SEQ ID NO：1），5'-TGGCAGTGATGGCA TGGACTG-'3（SEQ ID NO：2），所述用于试验测试的上下游引物使用浓度为10-30pmol，优选上下游引物使用浓度为20pmol，扩增片段长度为600bp；所述PCR扩增酶混合液包括热启动Taq酶、GP32蛋白；其中热启动Taq酶的用量为3-8U/人份，GP32蛋白的用量为0.05-0.2U/人份。