[发明专利]一种检测土壤中重金属污染物潜在遗传毒性的方法

权利要求书

1.一种检测土壤中重金属污染物潜在遗传毒性的方法，其特征是：它包括如下步骤：

步骤1.土样的前处理：采集土壤样品，风干后，过直径为2mm的土筛，去除植物残体、石块等后，用玛瑙研钵研磨，全部通过80目筛。土壤经消解后，用1ml硝酸温热溶解残渣，然后将溶液转移至50ml容量瓶中，定容，摇匀，保存备用；

步骤2.细胞制备：将微藻细胞接种到步骤（1）得到的土壤金属提取液中进行染毒，将去离子水染毒的微藻细胞作为对照；将上述染过毒的微藻细胞分别经离心去除液体部分，用PBS重新悬浮细胞，得到细胞悬液，离心纯化备用；

步骤3.铺胶：

步骤3a.以1%g/mL的正常熔点琼脂糖（NMA）PBS溶液（1%g/mL即100mLPBS中加入1g NMA，以下定义相同）300--500μL在磨砂载玻片上打底，再刮去，这样可以使第一层胶更容易固定住载玻片上；

步骤3b.制备第一层胶：将60--120μL0.7%g/mL的正常熔点琼脂糖（NMA）PBS溶液滴在步骤3a得到的磨砂载玻片上，迅速盖上盖玻片，4℃固化5-10min；

步骤3c.制备第二层胶：向步骤2处理得到的细胞中加入0.7%g/mL的低熔点琼脂糖（LMA）PBS溶液，重悬藻泥，吹打均匀成细胞悬液，调整细胞浓度1×10⁵--1×10⁶个细胞/mL。然后取出第一层胶已凝的玻片，轻拔移除盖，取50--120μL加到第一层胶上，盖上盖玻片，4℃固化30-40min；

步骤3d.制备第三层胶：第二层凝固后，取50--120μL1%g/mL的正常熔点琼脂糖（NMA）的PBS溶液铺第三层胶，盖上盖玻片后，放入冰箱使其凝固；

步骤4.裂解：将步骤3d制备好的载玻片去掉盖玻片，浸入4℃碱性裂解液（2.5mol/LNaOH，1.0mmol/L Na₂-EDTA，0.01%SDS（w/v），pH=10，用前加入1%TritonX-100和10%DMSO），裂解10min-2h；

步骤5.电泳：取出裂解后的载玻片，放入电泳槽，向槽中缓慢注入碱性电泳液(pH=13.0),静置20min后开始电泳，电流200--300mA，电压18--25V，电泳时间20min；

步骤6.中和：用pH7.5、0.4mmol/L Tris-HCl缓冲液浸没载玻片，漂洗每次5min，中和3次；

步骤7.染色：胶上滴加50μg/mL的溴化乙锭（EB）30μL，加盖盖玻片，24h内镜检；

步骤8.DNA损伤程度分析：用荧光显微镜在绿光激发下观察，拍照，获取彗星图像后，用CASP软件分析测量DNA迁移的参数：尾矩（TM）和尾动量（OTM），用其评价土壤中重金属潜在的遗传毒性。

步骤9.实验至少设3个平行，取其平均值；统计用Origin7.5软件进行ANOVA分析，将实验组和对照组进行显著性t检验，以p<0.05作为显著性依据。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤1中，所述的消解操作过程如下:

称取0.2000g过80目的风干土样于30ml聚四氟乙烯坩埚中，加5ml HCl低温加热，使样品初步分解，待蒸发至2-3ml时，取下稍冷，然后加入5ml硝酸（工艺超纯），3ml氢氟酸、3ml高氯酸，加盖后于电热板上中温加热1小时左右（注意温度不要太高，以免溶液冒出），然后开盖，继续加热除硅，并经常摇动坩埚以达到良好的飞硅效果，

当加热至冒浓厚高氯酸白烟时，加盖，使黑色有机碳化物充分分解，待坩埚上的黑色有机物消失后，开盖驱赶白烟并蒸至内容物呈粘稠状，视消解情况可再加入2ml硝酸、

2ml氢氟酸、2ml高氯酸重复上述过程，当白烟再次基本冒尽且内容物呈粘稠状时，取下稍冷，用水冲洗坩埚盖和内壁。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤2和步骤3中，所述的微藻细胞为纤细裸藻细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤3a以1%g/mL的正常熔点琼脂糖350μL在磨砂载玻片上打底。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤3b是将100μL0.7%g/mL的正常熔点琼脂糖滴在步骤3a预制得到的载玻片上。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征是：步骤3c中是取75μL细胞悬液滴加到第一层胶上。