[发明专利]一种制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及疫苗制备领域，具体地说，涉及一种制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法。

背景技术

流行性腮腺炎，简称腮腺炎或流腮，是由腮腺炎病毒所致的急性全身性传染病。腮腺炎在世界范围内流行，全年均可发病，以冬春季为主。任何年龄均可发病，以5-15岁患者居多，1岁以下和15岁以上很少发病。感染后一般可获得终身免疫。感染潜伏期14～25日，平均18日。临床特征为腮腺肿痛，可伴发热、头痛等。早期患者及隐性感染者均为传染源。通过空气飞沫或直接接触唾液及唾液污染的食具玩具等传播。MuV是腮腺炎最常见的病因，可引起脑炎、睾丸炎、卵巢炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎、心肌炎、乳腺炎、甲状腺炎等。大多数严重并发症在成人中较多见，青春期后男性患者中25％出现睾丸炎。有1-10％临床腮腺炎患者出现轻型无菌性脑膜炎，腮腺炎脑膜炎可造成永久性后遗症，包括瘫痪、癫瘸、颅神经麻痹、脑积水等。经发现，妊娠早期（3个月内）感染腮腺炎病毒的孕妇中有25％会自然流产，其发生率高于风疹病毒感染。

在我国，尽管已在大范围人群内使用了疫苗，但是近年来腮腺炎呈现一种高发的态势，以卫生部公布的全国法定传染病疫情为例，流行性腮腺炎连续几年均高居全国丙类传染病报告数的第二位。国际通用的Jeryl--Lynn株及我国使用的S79株减毒毒种均属于流行于60年代后的A基因型，而当前我国流行的腮腺炎病毒株主要为F基因型。不同基因型之间的中和抗原会有一定差异，可能会导致不完全交叉性保护。我国近10年来腮腺炎减毒活疫苗纳入免疫规划，无偿接种，但腮腺炎的发病率依然维持在较高水平。此外，目前我国常规使用的Jeryl-Lynn株及S79株减毒活疫苗均是以鸡胚细胞为基质进行生产而来的。鸡胚细胞（CEC）作为一种异源性细胞基质，可能带来过敏反应；可能携带传染性禽逆转录病毒；并且每批原代细胞质量不稳定，导致对同一个病毒灵敏度存在差异,影响产品的稳定性等不足。而使用人二倍体细胞进行腮腺炎减毒毒种的制备以及疫苗的植被，不存在致肿瘤的潜在危险性及其他不良反应，且有利于质量控制。

因而，通过人二倍体细胞基质对腮腺炎病毒进行培养和疫苗的制备，从而研究开发我国流行的绝对优势F基因型腮腺炎疫苗，对我国腮腺炎的防控具有重要意义和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种制备F基因型腮腺炎减毒活疫苗的方法，将腮腺炎减毒毒株MHM-19接种到培养至单层的人胚肺二倍体细胞MHL-3中，待病毒增殖高峰期，冻融细胞释放病毒，离心去除细胞碎片，向离心后的病毒悬液中加入保护剂，制成F基因型腮腺炎减毒活疫苗半成品，将半成品进行冷冻干燥，即得F基因型腮腺炎减毒活疫苗成品。

其中，保护剂配方为：右旋糖酐6%、蔗糖15%、海藻糖9%、精氨酸0.3%、尿素1.5%、人白蛋白1%和谷氨酸钠1.5%，以PBS缓冲液配制。

具体地，上述方法包括如下步骤：

1）在细胞瓶内培养人胚肺二倍体细胞MHL-3至细胞长成单层，用0.25%胰蛋白酶溶液消化成单个细胞，去除细胞瓶内的胰蛋白酶溶液，加入MEM细胞培养液稀释至10⁵个细胞/mL，然后接种于CELL FACTORIES（丹麦NUNC公司）或CELL STACK（美国CORNING公司），置于37℃培养；

2）待MHL-3细胞长成单层弃去培养液，用Earl’s液清洗细胞表面；

3）按MOI=0.1接种F基因型腮腺炎减毒毒株MHM-19的病毒悬液，加入MEM维持液置于33℃培养；

4）培养48h后，弃去维持液，用Earl’s液清洗细胞表面，加入MEM维持液置于33℃培养；

5）待MHL-3细胞完全病变（病变达++++），冻融三次，释放病毒，制成腮腺炎病毒悬液，4000rpm/min、4℃离心，去除细胞碎片；向离心后的病毒悬液中加入保护剂，制成F基因型腮腺炎减毒活疫苗半成品；

6）将半成品分装并进行冷冻干燥，制成F基因型腮腺炎减毒活疫苗成品。

步骤1）中使用丹麦NUNC公司生产的CELL FACTORIES或美国CORNING公司生产的Cell STACK，译为细胞工厂或细胞培养室，两者培养原理相同，外观尺寸略有不同。细胞工厂可有效节省空间和培养液，保证操作的无菌性。