[发明专利]IBV、CSFV和NDV的高分辨熔解基因分型

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年12月18日提交的美国临时申请61/738,688的优先权。

技术领域

本发明涉及使用高分辨熔解技术区分和表征IBV、CSFV和NDV毒株和鉴定新毒株的方法。本发明还提供随这类方法使用的底物和试剂盒。

发明背景

聚合酶链反应(PCR)是一种引物延伸反应，所述反应提供一种在体外扩增特定DNA或多核苷酸、产生数千个至数百万个特定DNA序列副本的方法。PCR现在是医学研究实验室和生物学研究实验室中用于多种应用的常见和经常不可替代的技术。这些应用包括用于测序、基于DNA的系统发生或基因功能分析的DNA克隆；诊断遗传疾病；鉴定遗传指纹；及检测和诊断传染病。基本PCR的某些变型包含定量实时PCR(qPCR或RT-PCR)、等位基因特异性PCR、非对称PCR、热启动PCR、逆转录PCR、多重PCR、巢式PCR、连接介导的PCR、序列间特异性PCR、热不对称交错PCR和温度递降PCR。这些PCR变型针对不同用途提供广泛类型的用途。例如，可以通过等位基因特异性PCR鉴定单核苷酸多态性(SNP)(DNA中的单碱基差异)、qPCR可以在PCR反应中扩增的副本数目提供极高精度(Bartlett等人,“A Short History of the Polymerase Chain Reaction”，PCR Protocols,2003)。

最近，增加了高分辨熔解(HRM)法作为一种用于高通量突变扫描的新分子技术(Zhou,L.等人,Clin.Chern.51,1770-1777,2005)。使用HRM确定突变基于与双链DNA相互作用的荧光染料存在下暴露于递增温度时DNA的解离(参见，例如US7,387,887；US7,582,429)。本领域中存在许多适宜的染料。突变的存在导致DNA异源双链体形成，随后熔解行为改变。因此，这种“突变扫描”技术检测靶基因衍生的PCR扩增子中序列变异的存在。在HRM实验中，首先在高分辨熔解染料存在下借助实时PCR扩增样品DNA。这类染料的知名实例在WO 2008/052742中公开。在PCR后，后续熔解实验可以在同一个实时仪上进行，并用相应的基因扫描软件分析以鉴定序列变体。

经典猪瘟(CSF)，先前称作猪霍乱，是一种侵袭家猪和野猪的高度接触性和多系统出血性疾病，它在全球养猪业中造成经济损失并且根据陆生动物卫生法典，是世界动物卫生组织法定报告疾病(OIE，2007)。致病因子是经典猪瘟病毒(CSFV)，它是一种有囊膜、正义、单链RNA病毒，归属于黄病毒科(Flaviviridae)的瘟病毒属(Pestivirus)。在遗传水平，基于E2基因和NS5B基因的部分序列，CSFV可以划分成基因型1、2和3。每个基因型可以划分成亚基因型，分别称作1.1、1.2和1.3；2.1、2.2和2.3；以及3.1、3.2、3.3和3.4(Paton等人,Vet Microbiol.73:137-157,2000)。在亚洲，CSF流行性是普遍存在的，并且已经在几个亚洲国家分离基因型1、2和3。

CSFV可以引起急性、亚急性和慢性猪病，并且对全球养猪业造成重大威胁，造成严重经济损失。CSF的控制涉及根除或接种，其中根除是在发达国家如欧盟(EU)的优选控制方法，因屠宰感染猪造成庞大数量的损失。在另一方面，接种是在发展中国家如中国的主要控制策略。猪瘟兔化病毒(HCLV)(也称作C株)在二十世纪五十年代中期开发并且在中国和许多国家广泛使用(Moorman等人,J Virol.70:763-770,1996)。用HCLV疫苗大规模接种造成在接种的猪群中难以区分CSFV的野生型株和HCLV株(Van Oirshot,Vet Microbiol 96:367-384,2003)。CSFV亚临床感染和无症状感染是普遍存在的(Moennig等人,Vet.J.165,11-20,2003；Tu,Virus Res.81,29-37,2001)，产生无法由农民和兽医师可容易识别及无法通过一般检测法如病毒分离、抗原捕获ELISA和荧光抗体试验可检出的野生型CSFV感染。