[发明专利]蛋白质纯化

说明书

发明领域

本发明一般性地涉及纯的且稳定的NY-ESO-1相关多肽以及生产它的方法。

发明背景

被称为癌症-睾丸抗原(CT抗原)的、仅在肿瘤细胞和免疫赦免组织中一般性表达的一类蛋白的基因调控，在癌症患者中受到破碎。这导致这些抗原在多种肿瘤中异常表达。癌症患者中一些CT抗原的免疫原性使它们成为癌症疫苗开发的理想靶标。目前感兴趣的用于癌症免疫治疗的癌症睾丸抗原是NY-ESO-1。还鉴别了另一个癌症睾丸抗原，LAGE-1。已描述了两个LAGE-1转录物，LAGE-1a和LAGE1b。LAGE-1b被不完全剪接，并且编码推定的大约210个氨基酸残基的蛋白质(Sun et al. (2006) Cancer Immunol Immunother, 6: 55: 644-652)。

LAGE-1和NY-ESO-1蛋白的N末端区域是高度保守的，并被认为具有超过97%的同一性。但是，LAGE-1与NY-ESO-1的区别在于其中间区域只有62%相同。NY-ESO-1和LAGE-1a的C末端是高度保守的(超过97%的同一性)。但是，LAGE-1b的C末端较长并且不保守，并被认为与LAGE-1a/NY-ESO-1的相同区域的同一性小于50%。关于这些蛋白质的一般信息可以在LICR网站(参见www.cancerimmunity.org/CTdatabase)上找到。

重组CT抗原的纯化是制造基于CT抗原的癌症免疫治疗剂的一个步骤。已研究了各种方法以从重组产生的蛋白质中除去污染物如宿主细胞蛋白，并且有市售的试剂盒帮助开发从宿主细胞如大肠杆菌表达系统生产可溶性和活性重组蛋白的方法。参见，例如，“Tools for Enhancing Solubility of Proteins Expressed in E. coli and refolding screens for Difficult Targets, copyright 2008 EMD Chemicals Inc., an affiliate of Merck KGaA, Damstadt, Germany。尽管如此，在某些情况下，在获得足够纯度水平的CT抗原上遇到困难。

例如，已证明难以用标准的基于大肠杆菌的重组表达系统产生重组NY-ESO-1。参见Murphy (2005) Prep. Biochem. Biotechnol. 35:119-134。这种纯化方案涉及多个色谱步骤，伴随着NY-ESO-1蛋白的大量丧失。此外，所获得的低纯度水平引起了对根据已公开的纯化方法纯化的重组NY-ESO-1的免疫治疗用途的关注，因为可能有污染的大肠杆菌蛋白引起迟发型超敏反应。在解决这些问题上的努力导致使用被突变以兼容替代的表达系统如酵母的重组NY-ESO-1变体。参见Piatesi (2006) Protein Expression and Purification 48:232-242。

发明简述

本文提供NY-ESO-1相关多肽的纯化方法，以及用这些方法产生的多肽。还提供包含纯的且稳定的NY-ESO-1的组合物。

在一些实施方案中，提供纯化具有亲和标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤 (a) 在包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的缓冲液中溶解包含具有亲和标签的多肽的组合物，以获得混合物；和(b) 通过固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化所述混合物，以获得具有亲和标签的纯的多肽。

在一些实施方案中，合适的缓冲液包含20 mM Tris pH 8.0、5% N-月桂酰肌氨酸、20 mM咪唑、和5 mM TCEP。在一些实施方案中，组合物是细胞团块。在一些实施方案中，亲和标签是金属离子结合亲和标签。在一些实施方案中，亲和标签是his标签。

在一些实施方案中提供纯化具有亲和标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤 (a) 在包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的缓冲液中溶解包含具有亲和标签的多肽的组合物，以获得混合物；(b) 通过IMAC纯化混合物，其包含以下子步骤 (i) 将混合物加样在IMAC基质上；(ii) 用包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的第一缓冲液洗涤基质；(iii) 用包含脲、NaCl、和TCEP的第二缓冲液洗涤基质；(iv) 用包含脲、NaCl、和TCEP的洗脱缓冲液洗脱具有亲和标签的多肽，以获得具有亲和标签的纯的多肽。