[发明专利]蛋白质纯化

权利要求书

1.纯化具有亲和标签的NY-ESO-1相关多肽的方法，包括以下步骤：

(a) 在包含N-月桂酰肌氨酸和三（2-羧乙基）膦盐酸盐的缓冲液中溶解包含具有亲和标签的多肽的组合物，获得混合物；和

(b) 通过固定化金属亲和色谱(IMAC)纯化所述混合物，获得具有亲和标签的纯的多肽。

2.前述权利要求任一项的方法，其中所述缓冲液包含20 mM Tris pH 8.0、5% N-月桂酰肌氨酸、20 mM咪唑、5 mM TCEP。

3.前述权利要求任一项的方法，其中所述组合物是细胞团块。

4.前述权利要求任一项的方法，其中所述亲和标签是金属离子结合亲和标签。

5.前述权利要求任一项的方法，其中所述亲和标签是his标签。

6.前述权利要求任一项的方法，其中通过IMAC纯化混合物的步骤进一步包括以下子步骤：

(i) 将混合物加样在IMAC基质上；

(ii) 用包含N-月桂酰肌氨酸和TCEP的第一缓冲液洗涤基质；

(iii) 用包含脲、NaCl、和TCEP的第二缓冲液洗涤基质；

(iv) 用包含脲、NaCl、和TCEP的洗脱缓冲液洗脱具有亲和标签的多肽，获得具有亲和标签的纯的多肽。

7.前述权利要求任一项的方法，其中使用Ni2+基质进行IMAC。

8.前述权利要求任一项的方法，其中使用包含在柱中的基质进行IMAC。

9.权利要求6-8任一项的方法，其中所述第一缓冲液包含20 mM Tris pH 8、1% N-月桂酰肌氨酸、1 mM TCEP。

10.权利要求6-9任一项的方法，其中所述第二缓冲液包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP、和20 mM咪唑。

11.权利要求6-10任一项的方法，其中所述洗脱缓冲液包含20 mM Tris pH 7、8 M脲、0.5 M NaCl、1 mM TCEP、500 mM咪唑。

12.前述权利要求任一项的方法，进一步包括在通过IMAC纯化混合物的步骤之后，将具有亲和标签的多肽进行缓冲液交换的步骤。

13.权利要求12的方法，其中使用在葡聚糖 G-25柱上的色谱进行缓冲液交换。

14.权利要求12或13的方法，其中使用包含10 mM 乙酸钠pH 5的缓冲液进行缓冲液交换。

15.权利要求12-14任一项的方法，进一步包括在缓冲液交换步骤之后，浓缩并渗滤具有亲和标签的多肽的步骤。

16.权利要求15的方法，其中通过TFF进行浓缩和渗滤步骤。

17.权利要求15或16的方法，其中在缓冲液中的10 kDa再生纤维素C-screen膜上进行浓缩和渗滤。

18.权利要求15-17任一项的方法，其中在包含10 mM 乙酸钠pH 5的缓冲液中进行浓缩和渗滤。

19.前述权利要求任一项的方法，进一步包括在溶解所述组合物的步骤之后，使所述混合物澄清的步骤。

20.权利要求19的方法，其中澄清步骤进一步包括离心所述混合物。

21.权利要求19或20的方法，其中澄清步骤进一步包括混合物的过滤。

22.权利要求19-21任一项的方法，其中澄清步骤进一步包括离心混合物和混合物的过滤二者。

23.权利要求20或22的方法，其中离心步骤以15,900 x g进行。

24.权利要求21或22的方法，其中过滤步骤使用0.45/0.22um PES滤器进行。

25.前述权利要求任一项的方法，进一步包括在通过IMAC纯化所述混合物之前，破碎包含具有亲和标签的多肽的细胞的步骤。

26.前述权利要求任一项的方法，进一步包括使具有亲和标签的纯的多肽过滤的步骤。