[发明专利]包含嵌合巨细胞病毒启动子和增强子序列的表达载体

说明书

技术领域

本发明涉及哺乳动物表达系统，以及尤其涉及用于在哺乳动物细胞中异源表达感兴趣的核酸序列的包含嵌合启动子调控序列的表达构建体。嵌合启动子调控序列由源自鼠或人巨细胞病毒的启动子序列和源自人和/或猴巨细胞病毒的上游区和/或增强子序列组成，只要该序列元件源自至少两种不同的巨细胞病毒种。

背景技术

使用包括原核和真核细胞的各种遗传工程改造的有机体生产用于基础研究、诊断和治疗应用的重组(多)肽和蛋白，如抗体分子、疫苗、激素和生长因子。然而，绝大多数的重组肽或蛋白涉及翻译后修饰，当使用原核宿主细胞时翻译后修饰不能被模拟或再造。出于这个原因，已证明哺乳动物基因表达系统代表了一个优选的选择。

基于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞的哺乳动物表达系统被广泛地应用在重组蛋白生产中。除了淋巴细胞系，CHO细胞代表一些细胞类型中的一种，这些细胞类型允许简单有效的高密度悬浮分批培养动物细胞。此外，使用CHO细胞导致高的产物产量，而淋巴细胞更难于以工业规模培养。鉴于重组生产多肽和蛋白可观的成本，将每生物反应器运行的重组蛋白产量最大化同样至关重要。那些对产物产量有相当大影响的过程参数包括尤其是细胞培养条件、待表达的核酸(基因)的拷贝数、这些基因被转录和相应的mRNA被翻译的效率、mRNA稳定性等。

因此，控制基因表达的调控遗传元件的强度或转录活性的改进构成了为增加所生产的重组蛋白产量特别关键的因素。即使是转录活性在单细胞水平上小的增量增加将最终转化为高密度工业规模分批培养中产物产量相当大的改善。

哺乳动物基因表达系统的绝大多数使用在源自病毒的启动子调控序列控制下编码待表达的异源核酸序列的表达载体。在这些表达盒中两个最常用的病毒调控元件是人巨细胞病毒(hCMV)即早期基因1和2(IE1和IE2)的那些。然而，与使用hCMV IE1和IE2调控元件相关联的一个缺点是它们显著的物种特异性。

美国专利5,866,359公开可通过在弱启动子的控制下共表达腺病毒E1A蛋白改善来自此类hCMV启动子的基因表达。E1A是一种多功能转录因子，它可以作用于细胞周期调控，并且具有独立的转录激活和抑制功能结构域二者。E1A表达的微调对于实现基因反式激活和对细胞周期进展的任何负面影响之间理想平衡是重要的。然而，E1A表达的过表达可降低细胞合成感兴趣的重组蛋白的能力。

美国专利5,591,639描述了表达载体，其包含待表达的异源核酸序列的上游(5')、增强子、启动子和含有内含子A(即第一天然内含子)的人巨细胞病毒(hCMV-MIE)主要即早期基因的完整5'非翻译区。然而，如果存在该序列(约2100bp的总长度)的前400bp(5'-端)，则在COS7和CHO两种细胞中观察到不良的基因表达率(Chapman,B.S等人(1991)Nucl.Acids Res.19,3979-3986)。

鼠巨细胞病毒(mCMV)即早期基因调控元件的转录活性高于hCMV对应部分的转录活性，而不表现出人序列所观察到的明显物种偏好(Addison,C.L等人(1987)J.Gen.Virol.78,1653-1661)。

然而，试图通过插入mCMV IE启动子下游(3')的鼠主要即早期基因的天然第一内含子来提高mCMV IE启动子调控元件(类似于hCMV的对应部分)活性的尝试失败了(尤其参考欧洲专利1 525 320 B1)。然而，产生包含嵌合盒的表达载体导致和使用完整人序列时不相上下的产物产量，其中嵌合盒由mCMV IE1的调控元件和人主要即早期基因的天然第一内含子组成(参见，例如WO 2006/111387A2)。对于包含mCMV IE2调控序列的表达载体也获得了类似的基因表达率(尤其参见EP专利1 601 776 B1)。

因此，仍然需要产生高产量的所生产的重组多肽或蛋白的改善的哺乳动物基因表达系统。特别是，需要克服上述局限性的哺乳动物基因表达系统，即这样的表达系统基于所述mCMV或hCMV启动子序列，但是比现有系统实现更高的表达率(以及因此，产物产量)。

因此，本发明的一个目的是提供这样的基因表达系统，主要是适合的表达构建体和相应的哺乳动物宿主细胞。

发明内容

一方面，本发明涉及一种用于在哺乳动物细胞中异源表达感兴趣的核酸序列的表达载体，所述载体包含可操作地连接至第一待表达的核酸序列的第一嵌合启动子调控序列，其中所述嵌合启动子调控序列包含：