[发明专利]生物样品的稳定化

说明书

本发明提供了用于使含细胞的生物样品中的细胞外核酸群体稳定和用于使所包含的细胞的转录组稳定的方法、组合物和装置。

产生本发明的工作接受了来自于欧盟第七框架计划(European Community'sSeventh Framework Programme)(FP7/2007-2013)在拨款协议号222916下的资助。

技术领域

本文公开的技术尤其涉及适合于使含细胞的样品、特别是血液样品稳定的方法和组合物，并涉及从相应稳定化的生物样品分离核酸的方法。

背景技术

在诊断学领域中，核酸是重要的生物标志物。例如，基因组的转录本(特别是mRNA和miRNA)的情况在分子体外诊断学中被广泛用作生物标志物，为正常的生物和病理过程提供见解，并有望预测疾病结果和指示个体化的治疗过程。因此，核酸、尤其是RNA的情况分析，在疾病诊断、预后和用于生物标志物发现的临床试验中是重要的。从转录情况获得定量信息的能力，是探索基础生物学、诊断疾病、促进药物开发、为特定病理和遗传情况定制疗法以及产生与生物或治疗过程和途径相关的数据库的强有力工具。近年中，已对下游测定法和数据分析(分析过程)做出显著改进。然而，已发现预分析步骤例如特别是用于新的生物分子靶的样品操作和样品稳定化，对表达情况具有严重影响，并且可能损害后续分析(参见例如等，2001；Pahl和Brune，2002)。如果在待分析的样品的稳定化中不采取预防措施，样品将在运输和储存期间经历可能严重改变被靶向分子的表达情况的变化(参见例如Rainen等，2002；Baechler等，2004)。因此，基因表达、尤其是血液细胞的基因表达，对样品的离体操作敏感。如果由于样品的操作造成表达情况改变，后续分析不反映出样品以及因此患者的原始情况，而是测量在样品操作、运输和储存期间产生的人为情况。因此，需要使表达情况稳定从而允许进行可靠分析的优化的稳定化方法。尤其是，对于使血液样品稳定以便允许分析血液细胞的基因表达情况，存在着需求。

样品例如尤其是血液样品的较长期稳定化，在正式情况下通过添加有机溶剂例如苯酚和/或氯仿或通过在液氮中或使用干冰直接冷冻来进行。这些方法对于医院、医生手术或常规诊断实验室来说是完全不实用的技术。为了克服这些问题，PreAnalytiX开发了使用含有用于在收集样品的时间点立即使RNA基因表达情况稳定的试剂的真空血液收集管(PAXgene血液RNA管)来收集人类血液的第一种研究产品。相应的稳定化组合物允许在室温下运输和储存而没有由基因诱导和转录本降解引起RNA情况变化的风险(参见例如US 6,617,170，US 7,270,953，Kruhoffer等，2007)。实现样品、在这里是血液的立即裂解的其他稳定化试剂，由ABI/Life Technologies在名称Tempus血液RNA管产品下销售。另一种产品是Biomatrica Vacuette RNAgard血液管。使用这种管时裂解也在收集期间立即发生，并且RNA酶被失活，正如RNA随着血液温育时间保持完整所示出的。相应的方法的缺点在于稳定化引起细胞的完全裂解。细胞的破坏导致细胞内核酸变得与细胞外核酸混合，这阻止了这两种核酸群体的单独分析。此外，不仅分离的核酸的质量和数量以及它们相应的表达情况在分析上是重要的，而且样品例如血液样品中包含的特定细胞的存在、不存在或数目，在分析上也是重要的。由于任何细胞分拣或细胞富集以及相应的细胞分析变得不可能，因此细胞的破坏是极为不利的。

因此，通常提供具体地旨在用于细胞稳定化的特定稳定化试剂和相应的血液收集管。相应的产品允许调查样品在储存后的细胞含量，以例如通过荧光激活细胞分选(FACS)分析检测肿瘤细胞的存在，或通过流式细胞术(FC)或FACS分析检测不同白血细胞彼此的比率。例如，许多工作流程将标准的EDTA血液收集管用于流式细胞术或FACS分析，尽管血液细胞在储存时间内显示出少量裂解。来自于Streck Inc.的另一种产品是直接抽取式真空血液收集管，其用于保存全血样品用于通过流式细胞术进行免疫表型分型。其保存了白细胞抗原，使得白细胞的子集可以通过流式细胞术分析区分开来。维持白细胞分化抗原簇(CD)标志物的完整性的技术被例如US 5,460,797和US 5,459,073覆盖。