[发明专利]用于纯化转基因因子VII的方法

说明书

本发明涉及一种尤其是用于纯化转基因来源的重组人活化因子VII的抗因子VII亲和配体。组合其他正交色谱步骤的亲和配体允许制备高度纯化的FVII溶液，其完全活化、不含聚集体并具有低百分比的降解或氧化的FVII形式。

发明领域

本发明涉及尤其是用于纯化转基因来源的重组人活化因子VII的抗因子VII亲和配体。组合其他正交色谱步骤的亲和配体允许制备高度纯化的FVII溶液，其被完全活化、不含聚集体并具有低百分比的降解或氧化的FVII形式。

发明背景

因子VII(FVII)是一种维生素K依赖性糖蛋白，其活化形式(FVIIa)参与凝结过程，在钙和组织因子存在下活化因子X和因子IX。FVII是以406个残基的单肽链形式分泌，具有约50kDa的分子量。FVII包含四个独特结构的结构域：N端γ羧基结构域(Gla)、两个“表皮生长因子(EGF)-样结构域”以及丝氨酸蛋白酶结构域。FVII向FVIIa的活化表征为Arg152-Ile153结构域(精氨酸152-异亮氨酸153)连接的裂解。因此，FVIIa是这样的化合物：具有分子量约20kDa的152个氨基酸的轻链，并且具有分子量约30kDa的254个氨基酸的重链，通过单一的二硫键(Cys135-Cys262)彼此相连。

血浆的FVIIa包含几个翻译后修饰：前十个谷氨酸被γ-羧酸化，Asp63被部分羟基化，Ser52(丝氨酸52)和Ser60(丝氨酸60)被O-糖基化并且分别携带葡萄糖(木糖)0-2和岩藻糖型，Asn145(天冬酰胺145)和Asn322(天冬酰胺322)主要通过二触角(biantennary)二唾液酸化(bisialylated)的复杂结构被N-糖基化。

FVII用于治疗表现为因子VIII(A型血友病)或因子IX(B型血友病)缺陷的血友病患者，以及表现出凝固因子的其他缺陷的患者，例如，FVII的先天性缺陷。因此有必要获得注射用FVIIa浓缩物。

获取FVIIa浓缩物的最古老的方法是从通过血浆分级得到的血浆蛋白质中纯化FVIIa。为这一目的，EP 0 346 241描述了富含FVIIa的级分的制备，其在吸附、接着洗脱包含FVII和FVIIa以及其他蛋白质如因子IX(FIX)、X(FX)和II(FII)的血浆蛋白质的分级二级产物，特别是PPSB的预洗脱液(P＝凝血酶原或FII，P＝前转变素或FVII，S＝斯图亚特因子或FX，以及B＝抗血友病因子B或FIX)后获得。这种方法的缺点在于获取的FVII仍然含有一些痕量的其他凝固因子。

同样地，文献EP 0 547 932描述了基本上不含维生素K依赖因子和FVIII的高纯度FVIIa浓缩物的制备工艺。通过这一工艺获得的FVII，不管其纯度，但仍表现出残留的血栓形成活性。

一般而言，这些方法的主要缺点之一是它们只能产生小量的产物。此外，还难以获取完全不含在血浆中存在的其它蛋白质的产物。最后，尽管在制备血浆凝固因子的每个阶段都实施了一些预防措施来确保它们的病毒和细菌安全性(随访献血者、检测已知病毒和细菌污染的测试、严格的纯化和病毒失活处理以尽可能减少传输血液传播致病物的危险)，然而，并不完全排除致病物污染的风险。此外，克罗伊茨费尔特-雅各布病的新变种的出现造成了通过血液产品非常规致病物传播的恐惧。此外，从献血者采集的血浆体积仍然有限。

因此，自从二十世纪八十年代，编码人因子VII的DNA被分离出来(Hagen等人；Proc.Natl.Acad.Sci.,1986,83(8):2412-6)，并在各种表达体系中表达。

已进一步描述了多种用于重组因子VII的纯化的工艺(参见例如WO2009/141418)。目前的重组因子VII多肽通常是由一个或两个不同的多步工艺纯化，或者只采用在常规树脂上的色谱，或者包括使用具有蛋白质配体的亲合树脂的亲和色谱。