[发明专利]生产D-乳酸的新型菌株及其用途

说明书

发明背景

1.发明领域

本发明涉及新型D-乳酸生产菌株及其用途。具体地，本发明涉及制备D-乳酸生产菌株的方法，其包括以下步骤：抑制L-乳酸生产菌株中L-乳酸脱氢酶(L-LDH)活性并引入D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性；通过上述方法制备的修饰的D-乳酸生产菌株；和生产D-乳酸的方法，其包括以下步骤：培养菌株和从培养肉汤(culture broth)中回收D-乳酸。

2.相关技术的描述

乳酸在食品、药品、化妆品等方面具有广泛的工业应用。近几年，乳酸已被用作聚乳酸单体，从而对乳酸的需求有了显著的增长。

可通过化学合成或通过使用碳水化合物作为底物的生物发酵方法生产乳酸。从商业角度来看优选后者，因为乳酸的化学合成会引起由气体价格上涨造成的成本增加或环境污染的问题。此外，还存在的问题有生成由等量的D-乳酸和L-乳酸组成的外消旋混合物形式的L-乳酸。不幸的是，无法控制D-乳酸和L-乳酸的组成比率。当使用外消旋混合物形式的乳酸制备聚乳酸时，产生低熔点的无定形聚合物，从而限制了其应用。另一方面，使用微生物的生物发酵方法可依据所使用的菌株而选择性地生产D-乳酸或L-乳酸。例如，诸如乳杆菌(Lactobacillus sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、根霉菌(Rhizopus sp.)、链球菌(Streptococcus sp.)或肠道球菌(Enterococcus sp.)的微生物通常生产L-乳酸。诸如明串珠菌(Leuconostoc sp.)和Lactobacillus vulgaricus的微生物通常生产D-乳酸。尤其是，由于D-乳酸不在体内代谢，D-乳酸可作为生物材料应用于医药领域并且通过酯化作用和氯化作用还可用作光学活性除草剂。已经知道，光学活性除草剂可以显著提高其药效并且用较小的量也有相同的药效。为此，对D-乳酸的需求不断增加。此外，sc-聚乳酸(立构复合物-PLA)的熔点和热降解温度明显高于已知的聚乳酸。因此，其可用作由纯L-聚乳酸和纯D-聚乳酸的混合物所产生的高耐热性塑料材料。因此，需要D-乳酸单体，并且它的需求正在逐渐增加。

在生产此类光学纯D-乳酸中，优选采用微生物酶的对映选择性底物特异性的生物发酵方法。然而，通常发现于自然界中的野生型D-乳酸生产微生物就光学纯度和生产率而言仍不适用于工业用途。D-乳酸生产微生物的例子为植物乳杆菌(Lb.plantarum)、戊糖乳杆菌(Lb.pentosus)、发酵乳杆菌(Lb.fermentum)、德氏乳杆菌(Lb delbrueckii)等。然而，存在的缺点有，它们不能以高生产率和高收率生产乳酸，并且20～40％的乳酸是作为光学杂质的L-乳酸。为了克服这些缺点，进行了许多尝试，以通过用EMS(甲基磺酸乙酯)处理诱导乳酸生产细菌中的突变从而开发在高葡萄糖培养基中生产高浓度乳酸的变体(J.Industrial Microbiol,11:23-28,1992)。结果，选出显示比对照组高约4.8倍生产率的菌株，但是其活性在长期储存过程中会降低。同时，在使用变体进行菌株开发的情况下，收率改进的菌株倾向于显示降低的生产率，而生产率改进的菌株倾向于显示降低的收率。

基于这样的构思：用于工业乳酸发酵的菌株通常是L-乳酸生产微生物，并且这些微生物相比于D-乳酸生产微生物大多数都有优异的生产率和收率，本发明人发现，可以通过在高L-乳酸生产微生物中使L-乳酸脱氢酶(L-LDH)编码基因失活，然后在其中引入异源D-乳酸脱氢酶(D-LDH)编码基因而以高收率生产D-乳酸，从而完成本发明。

发明概述

本发明的实施方式提供制备修饰的D-乳酸生产菌株的方法，其包括以下步骤：在L-乳酸生产菌株中使L-乳酸脱氢酶活性减弱或失活并使D-乳酸脱氢酶活性引入或增强。

本发明的其它实施方式提供修饰的D-乳酸生产菌株，该菌株通过上述方法制备。

本发明的另一个实施方式提供使用修饰的D-乳酸生产菌株生产D-乳酸的方法。

附图简述

图1显示了一张图表，其呈现出由10种不同类型的野生型乳酸生产微生物生产的D-乳酸和L-乳酸比率的分析结果。

优选实施方式详述

本发明的实施方式提供通过在L-乳酸生产菌株中使L-乳酸脱氢酶(L-LDH)活性减弱或失活并使D-乳酸脱氢酶(D-LDH)活性引入或增强而制备修饰的D-乳酸生产菌株的方法。