[发明专利]克隆方法

权利要求书

1.一种用于制备两种或更多种标准化的表达盒的方法，所述方法包括：

a.提供两组或更多组元件序列，

每组元件序列一起构成至少一种功能性表达盒，

各元件序列的两侧侧翼为IIs型限制核酸内切酶切割位点，之后是其识别位点，

所述IIs型限制核酸内切酶识别位点和切割位点被选择成使得元件序列的组可组装成功能性表达盒；

b.提供至少两种骨架入门载体，

各骨架入门载体按以下这种顺序包含：(i)IIs型限制酶切割位点与其识别位点，和第一连接物序列(LF)；(ii)包含可选择标记基因的载体骨架；以及(iii)第二连接物序列(RF)，和IIs型限制酶识别位点与其切割序列；

任何骨架入门载体上的所述连接物序列RF和LF被选择成使得其可分别与相同或不同骨架入门载体上的LF或RF连接物序列进行组装；

所述连接物序列为左和右侧翼DNA序列，左和右连接物序列为适合使用序列同源性进行组装的序列，以及

c.使用基于使用IIs型限制酶消化和经由切割位点连接的方法，在至少两个骨架入门载体中组装所述两组或更多组元件序列作为功能性表达盒；

从而制备两种或更多种标准化的表达盒。

2.一种用于在宿主细胞中在靶位点处体内重组两种或更多种标准化的表达盒的方法，所述方法包括：

a.根据权利要求1所述的方法制备两种或更多种标准化的表达盒，其中：

i.RF和LF连接物序列包含同源重组序列；以及

ii.任何骨架入门载体上的RF和LF连接物序列被选择成使得其可通过体内重组分别与LF或RF连接物序列、与相同或不同骨架入门载体和/或与靶位点的侧翼序列进行组装；以及

b.从包含所述LF和RF序列的骨架入门载体回收表达盒；以及

c.在宿主细胞中在靶位点处将所回收的表达盒彼此体内重组。

3.一种用于在宿主细胞中在靶位点处将两种或更多种标准化的表达盒体内重组的方法，所述方法包括：

a.根据权利要求1所述的方法制备两种或更多种标准化的模块式表达盒，其中：

i.RF和LF连接物序列包含至少9个碱基对的同源序列；以及

ii.任何骨架入门载体上的RF和LF连接物序列被选择成使得其可使用这些序列通过体外方法分别与LF或RF连接物序列、与相同或不同骨架入门载体和/或与靶位点的侧翼序列进行组装；以及

b.从骨架入门载体回收表达盒，并且通过LF和RF序列的体外连接对其进行组装；以及

c.在宿主细胞中在靶位点处将所组装和回收的表达盒体内重组。

4.根据权利要求1、2或3所述的方法，其中至少两个骨架入门载体按以下这种顺序包含：(i)IIs型限制酶识别位点，之后是其切割位点，和至少25个碱基对的第一连接物序列(LF)；(ii)包含可选择标记基因的载体骨架；以及(iii)至少25个碱基对的第二连接物序列(RF)，和IIs型限制酶的另一切割位点，之后是其识别位点。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其中在两个整合序列存在下进行所述重组步骤，其中一个与第一表达盒和靶位点的侧翼序列重组，并且其中第二个与第二表达盒和靶位点的另一侧侧翼序列重组。

6.根据权利要求2或3所述的方法，其中，在所述重组步骤中，第一表达盒包含与靶位点的侧翼序列重组的整合序列，并且第二表达盒包含与靶位点的另一侧侧翼序列重组的整合序列。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述整合序列包含与用于第二靶位点重组的另外的序列。

8.根据权利要求5所述的方法，其中所述整合序列介导经由同源重组或位点特异性重组的整合。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述整合序列、连接物或其它元件序列包含用于与所述第二靶位点重组的位点特异性重组序列，所述位点特异性重组序列位于所组装的表达盒之外并且允许使用位点特异性重组在所述第二靶位点处进行重组。

10.根据权利要求2或3所述的方法，其中在所述靶位点处按预定顺序顺次组装并重组两种或更多种表达盒。

11.根据权利要求1、2或3的方法，其中至少一种表达盒为标记物表达盒。