[发明专利]一种利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法

权利要求书

1.一种利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，包括如下步骤：

(1)准备传代细胞

将长满单层的细胞，用EDTA一胰酶消化分散，利用血清浓度为0.5%的细胞培养液终止消化，按照1:1传代比例获得传代细胞悬液，将细胞悬液铺96孔细胞培养板，每孔50uL；

(2)测定猪瘟活疫苗在传代细胞中的病毒含量

取4℃预冷细胞基础培养液，在冰盒上将猪瘟活疫苗进行10倍的倍比稀释，将不同稀释度的病毒悬液加入到（1）中96孔细胞培养板上的细胞悬液中，置于37℃温箱中吸附，2h后取出，每孔补加含1.5～2倍血清浓度的细胞培养液，每孔100uL，将培养板重新置于培养箱中培养72h，同时设立不接毒正常细胞对照；

(3)荧光染色接毒细胞

①将细胞培养板从培养箱中取出，弃去培养板孔内液体，用PBS洗涤2～3次，每次2～3min，并轻轻甩干；

②加入-20℃下预冷的甲醇，在4℃条件下固定20～30min；

③弃去甲醇，室温下自然挥干5min，PBS洗涤2～3次，每次2～3min，并轻轻甩干；

④加入PBS稀释的猪瘟阳性血清一抗，在37℃条件下吸附50min；

⑤弃去猪瘟阳性血清一抗，PBS洗涤2～3次，每次2～3min，并轻轻甩干；

⑥加入PBS稀释的兔抗猪荧光二抗，在37℃下吸附40min；

⑦弃去兔抗猪荧光二抗，PBS洗涤2～3次，每次2～3min；

⑧置于荧光显微镜下观察荧光情况，判定猪瘟活疫苗感染滴度。

2.根据权利要求1所述利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中猪瘟活疫苗稀释在0～4℃低温环境下进行。

3.根据权利要求1所述利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，其特征在于，所述步骤(2)中病毒接细胞后72h进行间接免疫荧光检测。

4.根据权利要求1所述利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，其特征在于，所述步骤(3)中猪瘟阳性血清一抗的稀释倍数为40倍，兔抗猪荧光二抗的稀释倍数为32倍。

5.根据权利要求1所述利用间接免疫荧光检测猪瘟活疫苗病毒含量的方法，其特征在于，所述步骤(1)中预冷细胞基础培养液为MEM培养基。