[发明专利]高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种红曲成分的测定方法，尤其是一种高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法。

背景技术

γ-氨基丁酸（γ-aminobuyric acid，GABA）是广泛存在于动植物体内的一种具有生理活性的非蛋白质氨基酸，具有调节心血管活动和心律失常以及营养神经细胞等多种生理功能。随着研究的深入，GABA已经发展成为一种新型的功能性因子，并逐渐应用于医药、食品和饲料工业中。红曲菌(Monascus sp．)是我国传统的食品发酵微生物，能产生丰富的酶类、色素以及多种生理活性物质，在食品着色、酿造、医疗保健等方面得到较广泛应用。动物和临床试验表明，红曲菌的发酵产物红曲具有很强的降血压作用，GABA被认为是其降压的主要成分。

目前常用的GABA检测方法有薄层色谱、纸层析法、比色法、氨基酸分析仪测定、毛细管电泳-电化学检测、高效液相色谱法。各种方法均有其优缺点，其中薄层层析方法灵敏度高、检测方便，但是检测耗时比较长；纸电泳法成本较低，无需昂贵的试剂以及仪器，缺点是需要控制温度、pH以及滤纸本身性质等的影响，操作过程繁琐；纸层析法简单有效费用低廉，缺点是精密度不高，检测时间较长；氨基酸分析仪检测准确、简便省时、稳定性好，缺点是设备昂贵、对样品的纯度要求很高，测定条件需要严格控制；毛细管电泳法灵敏度高、成本低、试剂用量少，但是操作过程过于复杂；高效液相色谱法精确度和灵敏度均很高，可满足大部分科研和生产过程中检测的需要。

高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）检测GABA需要使用衍生化试剂处理，所使用的衍生化试剂主要有邻苯二甲醛（OPA）、2,4-二硝基氟苯（FDNB）、异硫氰酸苯酯（PITC）以及6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰亚氨基甲酸酯（AQC）等，其中使用OPA衍生GABA，操作简单，反应迅速抗干扰能力强，且毒性较小，是比较理想的衍生化试剂。但由于红曲产品中成分复杂、杂质较多，干扰检测效果的因素较多，因造成检测结果准确性较低、偏差较大，不太稳定可靠。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可有效减少杂质对检测的干扰，增加检测准确性的高效液相色谱法测定红曲中γ-氨基丁酸含量的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的测定步骤为：（1）γ-氨基丁酸的提取：将称取的红曲样品加到水中，超声提取，离心分离收集上清液；

（2）醇沉：在上清液中加入乙醇和无机盐溶液进行醇沉处理，离心分离得到醇沉上清液；

（3）酶处理：醇沉上清液脱除溶剂，然后加入复合酶制剂进行酶处理；

（4）脱色素处理：将酶处理后的浓缩液上柱吸附，树脂吸附、氨水洗脱；洗脱液用微孔滤膜过滤，所得过滤液即为待检测液；

（5）所述待检测液经柱前衍生化处理，即可采用液相色谱法测定。

本发明所述步骤（1）中，红曲样品加到10～30倍体积超纯水中，超声提取1～4h；所述提取和分离步骤重复2～5次，合并上清液。

本发明所述步骤（2）中，上清液加入1～2倍体积的乙醇和1/5～1/10体积的5wt%～10wt%无机盐溶液，在-10℃～4℃静置处理10～30min。所述无机盐为醋酸钾、醋酸铵或硫酸铵。

本发明所述步骤（3）中，复合酶制剂为蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶和果胶酶的混合物；酶处理温度为25～55℃，pH为3.5～9.0，静置处理30～60min。

本发明所述步骤（4）中，层析柱的柱床高为15～20cm，采用0.2～2mol/L的氨水洗脱。

本发明所述步骤（5）中，采用邻苯二甲醛和β-巯基乙醇为衍生化试剂进行柱前衍生。所述待检测液中加入1～8倍体积衍生化试剂，避光混合1～5min进行衍生，然后微孔滤膜过滤。

本发明所述步骤（5）中液相色谱法的测定步骤为：首先采用液相色谱检测一系列具有梯度浓度的γ-氨基丁酸标准溶液，绘制峰面积-浓度标准曲线；再将经柱前衍生化处理的检测液用液相色谱检测，根据峰面积-浓度标准曲线，即可得到红曲样品的γ-氨基丁酸含量。

所述液相色谱法的测定条件为：色谱柱为反相C18柱；检测波长为338nm；色谱柱温度为室温；流动相A和流动相B按比例混合均匀，其中流动相A所占比例为30～70%，使用前经微孔滤膜过滤，超声波脱气后使用；流动相流速为0.5～1.5mL/min；进样量10～20μl。