[发明专利]一种抗丙肝病毒的中和性单克隆抗体的制备及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学和感染免疫领域，具体涉及一种抗丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus,HCV）的中和性单克隆抗体及产生该抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

我国是HCV（丙型肝炎病毒，丙肝病毒）高感染率国家之一，HCV感染是导致慢性肝炎、肝癌、肝硬化的主要因素之一，严重影响人类健康。目前尚无有效的治疗和预防性HCV疫苗,也无有效中和性治疗抗体。

HCV的最终控制将取决于疫苗预防。在抵挡病毒的入侵过程和免疫抵抗HCV攻击人体细胞中，特异性中和性抗体发挥重要作用。HCV包膜(envelope)糖蛋白（E1和E2）能够诱使机体产生中和抗体，阻断病毒的入侵。包膜E2蛋白是诱导中和抗体的主要靶抗原，虽然E2蛋白的变异性较高，但近年在E2中鉴定出了一系列保守的中和抗体表位，这给HCV疫苗的开发带来了新希望。DNA疫苗的发展为一些难以体外表达的抗原提供了新的途径。其基本原理是将编码抗原的基因片断直接通过肌肉注射或基因枪等方法直接导入宿主体内，DNA体内摄取后，抗原蛋白的转录后修饰及立体构象和自然感染时所产生的抗原蛋白完全一样，抗原性好，DNA编码的可溶性抗原蛋白释放到细胞外后，被专职抗原递呈细胞（APC）摄取，然后经MHCⅡ类途径呈递，活化CD4+T细胞，及其随后产生抗体的B细胞活化，从而产生针对特异性抗原的抗体。

HCV病毒体基因编码3011个氨基酸的长开放读码框。在病毒复制中，氨基端有三个蛋白(C、E1、E2/NS1)，羧基端有四个蛋白(NS2、NS3、NS4、NS5)（Pwalotsky JM，Gastroenterology，2002，122(6)：1554—1568）。HCV E区包膜糖蛋白是诱导中和抗体的主要抗原区，故HCV E区及其编码的抗原是HCV疫苗研究的重点（Fournillier,et al.J.Virol,2001;75:12088）。HCV的包膜蛋白El和E2在病毒识别、粘附、侵入宿主细胞过程中发挥关键作用。E2含有中和性抗体的表位，可以诱导中和性抗体的产生。

糖基化是蛋白翻译后的重要修饰加工环节，可以诱导蛋白空间构象正确折叠，增加蛋白的酶亲水性，稳定性，并且可以调节蛋白的抗原性。E1和E2上含有多个保守的糖基化位点，即在HCV的不同基因型中糖基化位点均是保守存在的。其中E1有5个N-糖基化位点，E2上有11个（Goffard,A et al.，J.Virol,2005，79:8400-8409；Slater-Handshy et al，Virology,2004,319(1):36-48）。

尽管E1E2的功能和作用已经比较清楚，然而E1E2的免疫保护性仍然较低。另外，HCV的基因编码的E1和E2蛋白的分子量大小分别是：31KD和70KD，其原核表达蛋白不能形成蛋白质的糖基化，且表达困难，而真核表达的产量较低且纯化困难。因而E1E2在实际免疫保护中的应用受到了限制，不利于推广。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种抗HCV E2糖蛋白的具有中和病毒感染作用的单克隆抗体。

本发明的另一目的在于提供产生上述抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的再一目的在于提供上述杂交瘤细胞株的制备方法。

本发明的目的还在于提供上述单克隆抗体或杂交瘤细胞株的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现

一种产生抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：

（1）用重组质粒pVAX-CpG-N2N8（见本申请人在先中国专利申请“一种HCV的DNA疫苗及其制备方法”，申请号：201210258252.5，公开号：102746387A，公开日：2012-10-24）免疫Balb/c小鼠后，再用E2蛋白加强免疫；检测免疫小鼠血清针对E2蛋白的抗体效价。

（2）将针对E2蛋白抗体效价最高的小鼠无菌取脾作为抗原致敏的B细胞，并将其与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，再将融合细胞在HAT培养基中筛选，获取融合细胞生长克隆得到产生抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

所述的产生抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备方法，还包括如下步骤：得到产生抗HCV E2糖蛋白的中和性单克隆抗体的杂交瘤细胞株后，通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫印记（western blotting）筛选和鉴定后，选出具有高效价抗体水平的杂交瘤细胞株。