[发明专利]检测雌激素受体β基因RsaI多态性的方法和引物

说明书

技术领域

本发明属生命科学和生物技术领域，特别涉及一种用于雌激素受体β基因Rsa I多态性焦磷酸检测的引物序列，采用焦磷酸测序法技术，能对人类雌激素受体β基因多态性进行检测，特异性好，准确度高。 

背景技术

年轻女性月经过少是一种常见的妇科症状。其危害是影响孕卵在子宫内膜种植，导致反复流产、不孕等，是闭经的前驱症状。雌激素是调节月经的主要激素，但临床上发现一类病人其雌激素水平正常，无内外科及先天性疾病，这种疾病被称为原因不明月经过少。同时，对大量原因不明月经过少患者进行宫腔镜检查发现，月经过少患者中有许多人的子宫内膜光滑且薄，表现为生长发育不良。与传统的子宫内膜损伤、疤痕学说并不吻合，此外此类患者体内雌激素水平正常。Nilsson等认为雌激素受体(estrogen receptor,ER)基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)可能导致基因在转录、翻译水平失调，导致ER表达功能异常。研究发现雌激素受体(estrogen receptor,ER)有ERα和ERβ两种亚型。人雌激素受体β基因(estrogen receptorβ,ERβ)有第5外显子的配体结合区Rsa I和第8外显子3’非编码区Alu I常见多态性位点。ERβ基因的这种多态性可能会导致不同个体ERβ的表达水平或功能上的差异，进而影响体内雌激素生物学作用的发挥，所以从ERβ基因多态性角度探讨原因不明月经过少的发病机制，为进一步深入研究提供理论依据。 

在临床实验室中，目前检测雌激素受体β基因Rsa I多态性的常用方法为限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RELP）法，利用限制性内切酶能识别DNA分子的特异序列，并在特定序列处切开DNA分子，即产生限制性片段的特性，该方法的缺陷在于检测灵敏度低且只能检测大概型别，不能具体到突变比例。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种用于雌激素受体β基因Rsa I多态性焦磷酸测序检测的引物，所述引物包括从样本核酸中扩增雌激素受体β基因Rsa I核酸片段的特异性引物和对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物，其中从样本核酸中扩增雌激素受体β基因Rsa I核酸片段的特异性引物序列为： 

Rsa I F：5′-TGGAAACTAAGTTGCGCAGCT-3′（SEQ ID No.1） 

Rsa I R：5′-TGCCCTGCAAGTGTGAGATTT-3′（SEQ ID No.2） 

对获得的核酸片段进行焦磷酸测序的引物序列为： 

Rsa I S：5′-AGCCTGTTCGACCAA-3′（SEQ ID No.3）。 

进一步的，所述的Rsa IR的5′端用生物素标记。 

进一步地，焦磷酸测序采用正向测序。 

本发明还提供一种检测雌激素受体β基因Rsa I多态性的方法，其特征在于，包括以下步骤： 

(1)提取样品中的核酸； 

(2)提取的核酸加入PCR扩增反应液进行DNA扩增，PCR扩增的引物序列为： 

Rsa I F：5′-TGGAAACTAAGTTGCGCAGCT-3′（SEQ ID No.1） 

Rsa I R：5′-TGCCCTGCAAGTGTGAGATTT-3′（SEQ ID No.2） 

(3)取PCR扩增产物进行琼脂糖电泳，检测是否扩增成功； 

(4)对扩增成功的PCR产物进行焦磷酸测序，所述的测序引物为： 

Rsa I S：5′-AGCCTGTTCGACCAA-3′（SEQ ID No.3）。 

进一步地，所述PCR扩增反应液包括5×Buffer12μl，dNTP3μl，Taq酶3μl，上游引物3μl，下游引物3μl，纯水24μl。 

进一步地，PCR扩增的反应条件是95℃5分钟，98℃10秒；56℃20秒；68℃30秒，40个循环，68℃2分钟。 

本发明还提供一种检测雌激素受体β基因Rsa I多态性的试剂盒，包括样本DNA提取试剂、PCR扩增反应液、单链核苷酸模板纯化系统和焦磷酸测序体系，其中所述的PCR扩增的引物序列为： 

Rsa I F：5′-TGGAAACTAAGTTGCGCAGCT-3′（SEQ ID No.1） 

Rsa I R：5′-TGCCCTGCAAGTGTGAGATTT-3′（SEQ ID No.2）