[发明专利]一种漆酶突变体及其编码基因与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种漆酶突变体及其编码基因与应用。

背景技术

漆酶（EC.1.10.3.2）属于蓝色多铜氧化酶家族，能够氧化多种酚类及其他有机化合物，因而被广泛应用于染料降解，纸浆漂白，有机合成以及生物降解等工业领域。但是由于其比活力不高、稳定性差，价格较贵没有得到广泛应用。漆酶广泛的分布于真菌、细菌、植物等。其中以真菌中的漆酶研究最为广泛，真菌中表达的漆酶比活力较高，如变色栓菌、木腐层孔菌、糙皮侧耳等。但是他们表达的漆酶往往是含有几种同工酶的。有些同工酶的比活力很低，因此找到高比活力的漆酶并大量表达对推动漆酶的应用是意义的，同时漆酶是应用于工业领域的，其作用条件不是很温和，因此找到在不同pH值条件下热稳定性好的漆酶也是非常受欢迎的。

POXa1b是佛罗里达侧耳（Pleurotus florida）分泌的一种漆酶，其比活力约为151U·mg^-1，Faraco报道它具有惊人的热稳定性，在碱性条件下，其半衰期T₅₀为30天。毕赤酵母是近20年才逐渐发展起来的并已被广泛应用的外源蛋白高效表达宿主，具有生物量高，表达量高，生产成本低，产物稳定性好的优点。

因此，若能在佛罗里达侧耳（Pleurotus florida）中能够克隆得到和POXa1b的催化性质相近，比活力更高的酶，同时再将其在毕赤酵母中大量表达，推动其广泛应用将具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种漆酶突变体及其编码基因与应用。

本发明所提供的漆酶突变体，是在佛罗里达侧耳（Pleurotus florida）ACCC No.50035中野生型漆酶POXA1c（序列7）的基础上进行突变得到的，具有比活力高、作用的pH广泛等特点。具体而言，是如下（a）-（d）中任一种蛋白质：

（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质（POXA1cΔ13-R5V）；

（b）由序列表中序列3所示的氨基酸序列组成的蛋白质（POXA1cΔ13）；

（c）由序列表中序列5所示的氨基酸序列组成的蛋白质（POXA1c-R5V）；

（d）将（a）-（c）中任一所限定的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，且具有漆酶活性的蛋白质。

上述（d）中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（d）中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2、序列4或序列6所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的无义突变。

其中，序列表中序列7由513个氨基酸残基组成（POXA1c）；将序列7自N端起第5个氨基酸由精氨酸（R）突变为缬氨酸（V）即得到序列5（POXA1c-R5V）；将序列7自C端起缺失13个氨基酸即得到序列3（POXA1cΔ13）；将序列5自C端起缺失13个氨基酸即得到序列1（POXA1cΔ13-R5V）。

编码所述蛋白质（漆酶突变体）的核酸分子也属于本发明的保护范围。

所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。

在本发明的一个实施例中，所述核酸分子是编码所述蛋白质（漆酶突变体）的基因；所述基因具体可为如下1）至5）中任一所述的DNA分子：

1）编码序列为序列表中序列2所示的DNA分子（POXA1cΔ13-R5V）；

2）编码序列为序列表中序列4所示的DNA分子（POXA1cΔ13）；

3）编码序列为序列表中序列6所示的DNA分子（POXA1c-R5V）；

4）在严格条件下与1）-3）中任一限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白质（漆酶突变体）的DNA分子；

5）与1）-4）中任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码所述蛋白质（漆酶突变体）的DNA分子。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5%SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。