[发明专利]一种功能化聚酰胺-胺树状大分子的纳米复合物的应用

说明书

技术领域

本发明属于高分子纳米载体靶向基因转染领域，特别涉及一种功能化聚酰胺-胺树状大分子的纳米复合物作为负载hBMP-2pDNA（人骨形态发生蛋白质粒DNA）诱导hMSCs（骨髓间充质干细胞）分化成成骨细胞的载体的应用。

背景技术

基因治疗作为一种现代医学和分子生物学相结合而诞生的新技术，是将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺失或异常引起的疾病，从而达到疾病治疗的新手。早在1968年，美国科学家迈克尔·布莱泽，首次在医学界提出了基因治疗的概念。但直到1990年，人类才首次进行了相关的临床试验。近十几年，很多临床试验都将基因治疗作为一种新颖的药用策略，应用于癌症、遗传性疾病、心血管疾病、免疫缺陷病和许多其它的障碍性疾病相关的基因缺陷或丢失。

然而，目前基因治疗最主要的障碍就是缺乏一种安全有效的传递表达载体，将遗传物质传递到生物体内所需的位置。在基因载体系统中，主要借助病毒和非病毒载体将外源基因导入靶细胞。病毒载体由于其高效的转染效率而被应用于临床上的基因治疗。但在将病毒载体作为基因运载工具应用于临床实验中的时候，却发现了很多安全隐患，比如基因突变、免疫原性，这些都进一步制约了其作为载体的广泛应用。而非病毒载体，由于其低细胞毒性、无免疫原性、易操作和高基因装载量等特点，越来越受到研究者们的关注。非病毒载体主要包括：阳离子脂质体、阳离子聚合物、壳聚糖载体聚合物和无机纳米粒子载体等。其中，阳离子聚合物中的树状大分子作为一种新型的，具有独特高度支化三维立体结构的高分子被广泛的应用于基因传递中。

树状大分子的转染能力依赖于其代数和表面的氨基数目，不同代数的树状大分子具有不同的表面氨基数目，因此选择合适代数的树状大分子显得至关重要。第五代聚酰胺胺（PAMAM）树状大分子，表面拥有的丰富氨基基团可进行多功能化修饰，结构内部的空腔可包裹药物分子或其它小纳米颗粒，单分散性的结构使其容易进入细胞，这些优异的特性促使我们利用第五代PAMAM树状大分子作为模板，在其表面修饰RGD和PEG，同时包裹金纳米颗粒，有望制备得到具有高效基因传递性能的功能化的树状大分子及其纳米颗粒，为新型的基因治疗体系的开发及其医学应用提供新的思路和参考价值。

检索国内外相关文献和专利结果表明：以功能化的树状大分子及其纳米颗粒为载体，用于骨髓间充质干细胞基因转染的方法，尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种功能化聚酰胺-胺树状大分子的纳米复合物作为负载hBMP-2pDNA诱导hMSCs分化成成骨细胞的载体的应用，该方法制备过程简单，实验条件温和，易操作，具有良好的基因转染表达结果，骨组织工程的修复和重建中有良好的应用前景。

本发明的一种功能化聚酰胺-胺树状大分子的纳米复合物作为负载hBMP-2pDNA诱导hMSCs分化成成骨细胞的载体的应用；

所述的功能化聚酰胺-胺树状大分子的纳米复合物具体为：{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀}；其制备方法如下：

（1）将NH₂-PEG-COOH溶液与6-MAL溶液搅拌反应6-8h，得到MAL-PEG-COOH溶液，然后加入RGD-SH溶液，搅拌反应10-12h，得到RGD-PEG-COOH溶液，随后经EDC和NHS溶液活化，再加入第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液中，反应12-30h，得到G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀溶液，然后将经EDC·HCl和NHS活化的mPEG-COOH溶液加入到上述G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀溶液中，反应12-30h，得到G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀溶液；

（2）在上述G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀中，加入HAuCl₄溶液，搅拌反应20-30min，再加入NaBH₄溶液，搅拌2-4h，得到{(Au⁰)₂₅-G5.NH₂-(PEG-RGD)₁₀-mPEG₁₀}溶液；