[发明专利]一种β-葡萄糖苷酶及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物应用领域，特别涉及一种β-葡萄糖苷酶及其应用。

背景技术

生物质转化为葡萄糖往往需要至少三种不同的酶蛋白的协同作用，外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶，CBH)，作用于纤维素线状结构的末端，水解β-1，4糖苷键，依次从纤维素的末端切下纤维二糖。它可以作用于纤维素的结晶区和无定形区。(2)内切葡聚糖酶(EG)。这类酶作用于纤维素结构内部的无定形区，随机水解β-1，4糖苷键，将长链的纤维素截短，产生大量含有非还原性和还原性末端的小分子纤维素。内切葡聚糖酶的作用是为外切酶提供大量的反应末端。(3)β-葡萄糖苷酶(BG)。这类酶将纤维二糖或者短链葡聚糖水解成葡萄糖。β-葡萄糖苷酶参与纤维素水解的最后一步，常常被认为是纤维素降解过程的限速酶，也是利用纤维素酶进行高效生物质转化的主要瓶颈之一。β-葡萄糖苷酶的主要功能有两个，其一是其可以分解纤维二糖产生葡萄糖，减少了纤维二糖对外切酶和内切酶的产物抑制作用；其二是其可以将葡萄糖进行转糖基作用合成有诱导作用的二糖物质，如龙胆二糖，槐糖。这些有诱导作用的二糖物质可以促进纤维素酶和半纤维素酶的诱导合成。虽然最常见的β-葡萄糖苷酶(Cel3A)已经被深入研究很多年，但是其转糖基作用不明显。为了进一步提高纤维素水解效率，和解析纤维素酶作用机理，亟待发掘新型的β-葡萄糖苷酶。

里氏木霉测序后发现真菌胞外存在七种潜在的β-葡萄糖苷酶，分别为Cel1A，Cel1B，Cel3A，Cel3B，Cel3C，Cel3D和Cel3E。Cel3E是胞外唯一一个没有被深入研究的β-葡萄糖苷酶，至今从未在真菌胞外粗酶液中分离出来，其酶学性质和生物学功能不明晰清楚。

发明内容

本发明是从桧状青霉的胞外分离纯化得到了新型的β-葡萄糖苷酶，其在纤维素酶诱导，木质纤维素降解方面发挥了独特的作用。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：

一种β-葡萄糖苷酶，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种β-葡萄糖苷酶的表达基因，其特征在于，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，从桧状青霉胞外粗酶液中分离如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶。

优选的是，从真菌胞外粗酶液中提取蛋白质，使用分子筛凝胶层析柱Sephadex S-200从蛋白质中分离出如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶。

优选的是，使用pH值为4.8～5.0的物质的量浓度为18～22mM的醋酸-醋酸钠溶液，以0.15～0.3mL/min冲洗所述分子筛凝胶层析柱。

一种如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶在诱导纤维素酶产生菌合成纤维素酶和半纤维素酶中的应用。

优选的是，利用β-葡萄糖苷酶将葡萄糖转化为龙胆二糖和槐糖，以诱导纤维素酶合成，以及利用β-葡萄糖苷酶将木三糖水解为木二糖，以诱导纤维素酶或者半纤维素酶合成。

一种如权利要求1所述的β-葡萄糖苷酶在提高纤维素酶产生菌胞外纤维素酶糖化水解效率中的应用。

优选的是，所述纤维素酶产生菌为里氏木霉或者桧状青霉。

本发明的有益效果是本发明是首次从真菌细胞的胞外粗酶液中分离出来，并且是从桧状青霉的胞外分离纯化得到的新型的β-葡萄糖苷酶，本发明所述β-葡萄糖苷酶PpCel3E与底物亲和能力极强，比如：以PNPG为底物，PpCel3E K_m值为0.0019mM，为已报道的真菌胞外β-葡萄糖苷酶K_m最低的。本发明所述β-葡萄糖苷酶在提高产纤维素酶真菌胞外纤维素酶糖化水解效率和在提高里氏木霉或者桧状青霉胞外纤维素酶糖化水解效率中起到很大的作用。本发明所述β-葡萄糖苷酶通过转糖基化作用将葡萄糖合成为龙胆二糖和槐糖以诱导纤维素酶合成，所述β-葡萄糖苷酶通过水解木三糖成为木二糖以诱导半纤维素酶合成。

附图说明

图1为本发明所述β-葡萄糖苷酶PpCel3E的同源树。

图2为本发明所述β-葡萄糖苷酶PpCel3E提高里氏木霉和桧状青霉的胞外纤维素酶糖化水解效率的比较图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。