[发明专利]一种体外诱导扩增NKT细胞的方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及一种免疫学领域，具体是指一种体外诱导扩增NKT细胞的方法。

[背景技术]

自然杀伤T细胞（NKT细胞）是继T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）之后又一类新型的T淋巴细胞，属于第4类免疫细胞。作为一种新型的免疫调节细胞，NKT细胞既表达T细胞的表面标志，又表达NK细胞的表面标志，NKT细胞具有细胞毒性和免疫调节作用。近几年在其表型特征、分布及发育、免疫学效应及与疾病关系、肿瘤治疗等方面的研究有了很大进展。

NKT细胞最显著的特征是其表达的TCR和NK细胞的激活受体，NKT细胞主要分布于肝、骨髓、胸腺、脾及外周血中，在外脐血中也有NKT细胞。NKT细胞最佳刺激效应物是α半乳糖神经酰胺（glycolipid α-galactosylceramide，α-GalCer），是一类来源于海绵体或者共生微生物的的提取物。最近，许多内源性的哺乳动物自身的脂质体也是CD1d的配体，能被NKT识别。

在细胞毒方面，NKT细胞在自身配体及合成配体的刺激下，其表面的IL-12受体活化，刺激DC细胞分泌大量的IL-12，并促使未成熟DC细胞的分化及成熟，而其本身迅速、大量的分泌IFN-γ，同时IFN-γ作用于NK细胞促使NK细胞亦分泌大量的穿孔素，DC细胞分泌的IL-12作用于初始CD4T细胞，使其向Thl极化，上述因素共同作用而介导某些病毒感染、胞内寄生菌感染的靶细胞和肿瘤靶细胞发生溶解破坏；也可通过表达FasL,经Fas/FasL途径使上述靶细胞发生凋亡。在免疫调节作用方面：活化NKT细胞可分泌IL-4和IFN-γ等细胞因子。IL-4可诱导CD4⁺Th0细胞向CD4⁺Th2细胞分化，参与体液免疫应答或超敏反应；IFN-γ与IL-12协同作用,可使CD4⁺Th0细胞向CD4⁺Thl细胞分化，增强细胞免疫应答。此外NKT细胞还可分泌多种趋化性细胞因子等参与炎症反应。

总之，NKT细胞作为一类新型的免疫调节细胞，在抗肿瘤、抗感染、抑制自身免疫性疾病及移植耐受中具有远大的应用前景。

[发明内容]

为了解决现有技术中的不足，本发明提供一种体外诱导扩增NKT细胞的方法，该方法诱导扩增出的NKT细胞分泌细胞因子水平高，杀瘤活性高。

为实现上述目的，设计一种体外诱导扩增NKT细胞的方法，其特征在于该方法由以下步骤组成：

a.改造白血病细胞株K562，使其表达CD1d、anti-CD28Mab：用淋巴细胞分离液分离初外周血单个核细胞（PBMC），采用RT-PCR方法分别从人PBMC中扩增CD1d、anti-CD28MAb cDNA,测序正确后，CD1d、anti-CD28MAb基因分别克隆至含有不同筛选标记的2种真核表达载体，先后转染K562细胞，筛选稳定表达的细胞克隆，构建K562稳定细胞株。（K562-CD1d-anti-CD28 MAb）；

b.用100Gy γ射线辐照K562稳定细胞株，用含有IL-2、IL-15和α-Galcer的培养基调整人外周血单个核细胞（PBMC）细胞浓度至1×10⁶/ml，两种细胞混匀后置于37℃、5%的CO₂培养箱中培养；每3～4天进行补液及传代，第12天收获细胞。

所述的K562稳定细胞株浓度∶外周血单个核细胞=1-4∶1。

步骤（b）中，IL-2的浓度为50U/ml。

步骤（b）中，IL-15的浓度为50ng/ml。

步骤（b）中，α-Galcer的浓度为50ng/ml-500ng/ml。

与常规方法比较仅使用NKT培养液培养的NKT细胞相比，本发明的方法有以下优点：稳定表达CD1d、anti-CD28MAb的K562细胞在α-GalCer存在的情况下可促进NKT细胞大量扩增，其效果明显优于单独用α-GalCer。

与常规仅使用α-GalCer培养NKT细胞的培养方法相比，本发明的方法具有以下优点：

1.稳定表达CD1d、anti-CD28MAb的K562细胞株，其表面表达CD1d分

子，限制性的递呈α-GalCer给NKT细胞，能够充分刺激NKT细胞增殖；

2.稳定表达CD1d、anti-CD28MAb的K562细胞株，其表面表达的anti-CD28MAb是协同刺激信号CD28的单克隆抗体，提供了NKT细胞增殖的活化信号；