[发明专利]一种生物法生产阿魏酸工程菌株及其构建方法

说明书

技术领域

本发明属于医药原料生产技术领域，具体涉及一种同时表达香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶和松柏醛脱氢酶的重组菌株及其构建方法，以及利用该菌株生产阿魏酸的生物转化方法。

背景技术

阿魏酸(Ferulic Acid)的化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是桂皮酸的衍生物之一。由于阿魏酸可以作为微生物发酵生产香兰素的前体物质，以及其所具有的抗氧化、抗血栓形成、降血脂、调节人体免疫功能等特性，阿魏酸及其衍生物被广泛应用于降血脂、防治冠心病和癌症、抗菌消炎、抗突变、活血通络、消除黄褐斑，以及失眠、腰酸腿沉等的医学治疗，保健品生产和食品添加剂领域。

目前国内外阿魏酸的制备方法主要从植物中直接提取，现在工业上普遍采用碱法降解米糠或麦麸中的谷维素制备阿魏酸,但由于该法受原料含量较低的限制，产量有限，成本较高。化学合成法以香兰醛和丙二酸为原料,通过缩合反应而成。但该法反应时间长,且生产的为反式和顺式阿魏酸的混合物，不易分离，同时化学合成法在环境污染方面存在一定问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一株串联高效表达表达香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因和松柏醛脱氢酶基因的重组大肠杆菌工程菌株。该香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因和松柏醛脱氢酶基因上游整合了T7启动子序列，在工程菌株中通过T7RNA聚合酶启动转录并最终高效表达。具体地说是通过在每一个基因前面加上T7启动子构成表达框，并且将三个表达框串联起来，这样第一个基因由一个T7启动子转录，第二个基因可由两个T7启动子转录，第三个基因可由三个T7启动子转录，以增加基因的表达量和酶的活性，从而达到大幅提高酶促反应活性的目的。

本发明的另一个目的是利用该工程菌株生产阿魏酸的生物转化方法。由于底物丁香酚具有一定的抑菌能力，在生物转化过程中会抑制工程菌株的发酵以及生化酶的表达，本发明采用两步法分别完成工程菌株的发酵和阿魏酸的生物转化。首先通过诱导发酵获得大量表达的香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶和松柏醛脱氢酶，再通过收集菌体、重悬浮作为酶液与底物丁香酚反应，以避免底物丁香酚对重组菌株的毒害抑制。，最终转化生成产物阿魏酸。

本发明为实现其目的所采用的技术方案：

一种重组菌株，同时表达香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶和松柏醛脱氢酶，其中，香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因和松柏醛脱氢酶基因上游分别整合T7启动子，在工程菌株中通过T7RNA聚合酶启动转录。

上述重组菌株的构建方法，包括如下步骤：

1.构建生产转化菌株pET-VAB

1）用Nde I和Bam HI分别双酶切合成的香兰醇氧化酶基因(vaoA,1683bp)、松柏醇脱氢酶基因(calA,768bp)和松柏醛脱氢酶基因(calB,1446bp)，克隆至用Nde I和Bam HI酶切过的pET24a载体上，得重组载体pET24a-vaoA，pET24a-calA和pET24a-calB。

2）将重组载体pET24a-vaoA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a-calA用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小为900bp左右片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-vaoA-calA。

3）将重组载体pET24a-vaoA-calA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a-calB用Bgl II和Eco RI酶切，回收大小为1.6kb左右片段，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-vaoA-calA-calB（pET24a-VAB）。

4）将重组载体pET24a-VAB转入BL21（DE3），得预期工程菌。

2.摇瓶培养发酵，采用大肠杆菌在下述条件下培养和发酵

1）种子培养基（质量百分比）和培养条件：蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%，余量为纯净水。37℃培养16小时，摇床转数为200rpm/min。

2）发酵培养基：蛋白胨1.2%，酵母提取物2.4%，甘油0.4%，磷酸二氢钾0.23%，磷酸氢二钾1.25%，余量为纯净水。

3）发酵培养条件：按发酵体积1%量接种，37℃培养，摇床转数为200rpm/min；接种2小时后，降温至25～28℃加入终浓度0.6mM IPTG，继续培养8小时。

3.阿魏酸的生物转化

1）发酵培养结束后，4℃下4000rpm/min离心收集菌体。

2）100mL磷酸缓冲液悬浮菌体，转入250mL转化瓶中，同时添加0.06mL的丁香酚底物。