[发明专利]一种生物法生产阿魏酸工程菌株及其构建方法

权利要求书

1.一种重组菌株，其特征在于，串联多重强表达香兰醇氧化酶、松柏醇脱氢酶和松柏醛脱氢酶，其中，香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因和松柏醛脱氢酶基因前面分别加上T7启动子构成表达框，并且将三个表达框串联起来，，在工程菌株中通过T7RNA聚合酶启动转录。

2.如权利要求1所述重组菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）用Nde I和Bam HI分别双酶切合成的香兰醇氧化酶基因、松柏醇脱氢酶基因和松柏醛脱氢酶基因，克隆至用Nde I和Bam HI酶切过的pET24a载体上，得重组载体pET24a-vaoA，pET24a-calA和pET24a-calB；

（2）将重组载体pET24a-vaoA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a-calA用Bgl II和Eco RI酶切，回收，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-vaoA-calA；

（3）将重组载体pET24a-vaoA-calA用Bam HI和Eco RI酶切，回收作为载体，pET24a-calB用Bgl II和Eco RI酶切，回收，与上述载体连接、转化，得重组载体pET24a-vaoA-calA-calB（pET24a-VAB）；

（4）将重组载体pET24a-VAB转入BL21（DE3），得预期工程菌BL21-VAB。

3.如权利要求2所述重组菌株的构建方法，其特征在于，步骤（1）进一步包括如下步骤：

用Nde I和Bam HI双酶切合成的香兰醇氧化酶基因(vaoA,1683bp)DNA片段；用Nde I和Bam HI双酶切载体pET24a(+)，酶切体系：DNA43μL，buffer R5μL，Bam HI1μL，Nde I1μL，37℃保温3小时；酶切的DNA片段胶回收，用T4连接酶连接vaoA和载体DNA片段，连接体系如下：vaoA7.5μL，pET24a载体1.5μL，buffer1μL，T4连接酶1μL，保温16℃过夜，连接产物采用热激法转化至大肠杆菌宿主菌DH5α中；涂布到含有1%蛋白胨，0.5%酵母膏，1%氯化钠及1.5%琼脂粉的LB固体培养基上；

LB平板在37℃培养至生长出转化子，挑取单菌落，用LB液体培养基37℃培养过夜，12000rpm/min离心1分钟，提取质粒，提取方法按照试剂盒说明书操作；

用Nde I和Bam HI双酶切重组载体，酶切体系：DNA43μL，buffer R5μL，Bam HI1μL，Nde I1μL，37℃保温3小时；

电泳确定含有目的vaoA基因的DNA片段。

4.如权利要求2或3所述重组菌株的构建方法，其特征在于，步骤（2）中回收大小为900bp左右片段，和/或，步骤（3）中回收大小为1.6kb左右片段。

5.如权利要求2-4所述重组菌株的构建方法，其特征在于，步骤（2）进一步包括如下步骤：将重组载体pET24a-vaoA用Bam HI和Eco RI酶切，酶切体系：DNA43μL，buffer R5μL，Bam HI1μL，Eco RI1μL，37℃保温3小时，DNA片段回收作为载体；pET24a-calA用Bgl II和Eco RI酶切，酶切体系：DNA43μL，buffer R5μL，Bgl II1μL，Eco RI1μL，37℃保温3小时，回收大小为900bp左右片段。

6.如权利要求2-4中任一项所述重组菌株的构建方法，其特征在于，步骤（3）进一步包括如下步骤：将重组载体pET24a-vaoA-calA用Bam HI和Eco RI酶切，酶切体系：DNA43μL，buffer R5μL，Bam HI1μL，Eco RI1μL，37℃保温3小时，回收作为载体；pET24a-calB用Bgl II和Eco RI酶切，酶切体系：DNA43μL，buffer R5μL，Bgl II1μL，Eco RI1μL，37℃保温3小时，回收大小为1.6kb左右片段。

7.如权利要求2-6中任一项所述重组菌株的构建方法，其特征在于，步骤（4）进一步包括如下步骤：采用热激法将重组载体转化至大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)中；涂布到含有1%蛋白胨，0.5%酵母膏，1%氯化钠及1.5%琼脂粉的LB固体培养基上；LB平板在37℃培养至生长出转化子，挑取单菌落，获得预期工程菌。