[发明专利]一种由海洋细菌分泌的褐藻胶裂解酶及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域。具体涉及一种由海洋细菌Cobetiasp. WG-007分泌的褐藻胶裂解酶及其制备方法。

背景技术

褐藻胶又称褐藻酸，是由 β-D-甘露糖醛酸（mannuronate，M）和 α-L-古洛糖醛酸（guluronate，G）组成的直链多糖。褐藻胶主要来源于海藻、海带、马尾藻和巨藻等，其结构复杂，物化性质多样，被广泛应用到医药、食品级化妆品等行业。褐藻胶裂解酶是一类通过β -消去反应断裂褐藻胶的酶，因其具有专一、高效及反应温和等优点，被视为改造褐藻胶的有力工具。此外，褐藻寡糖不仅具有良好的抗肿瘤活性和抗凝活性,还可以作为植物的生长促进剂。褐藻寡糖的制备方法主要由化学降解法，物理降解法和酶解法。相对前两种降解方法，酶法降解条件温和，不易破坏寡糖的结构，并且酶解方法所需要的设备简单，污染小。

褐藻胶裂解酶可用于降解褐藻细胞壁，而这种酶在人体内是缺乏的，褐藻的细胞壁破损后，海藻的营养价值得到进一步的提高。另外，褐藻胶裂解酶还可用于降解菌膜及生产生物燃料。因此，筛选褐藻胶代谢新菌株，寻找不同类型的酶对开发高值化褐藻胶及褐藻寡糖产品具有重要意义。

发明人通过文献检索、查阅资料所知，迄今为止报道的产褐藻胶裂解酶的菌株主要包括海洋细菌，黄杆菌(Flavobacuterium multivolum)、固氮菌(Azobacter vinelandii)、芽胞杆菌(Bacillus circulans)等。专利公开了Pseudomonas sp.HZJ216菌株产生的褐藻胶裂解酶分子量为60.25 KDa，Vibrio sp. JG07-007产的褐藻胶裂解酶的分子量为34.6 KDa等，经检索未见有Cobetia属的细菌产生与其相同的褐藻胶裂解酶。

发明内容

本发明的目的提供一株新型的高产褐藻酸裂解酶的菌株Cobetia sp.WG-007,利用该菌株发酵可生产高活力的褐藻胶裂解酶。该菌株生长周期短，培养成分比较简单，是一株极具开发研究价值的褐藻胶裂解酶的生产菌株。

本发明的发明人从国内生产褐藻酸钠的化工厂的废料样品,分离筛选获得一株产褐藻酸裂解酶的新型菌株,并对这株菌进行了发酵研究。根据其形态特征和生理生化特性,将其鉴定为Cobetia属, 命名为Cobetia sp. WG-007，该菌于2013年07月22日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学研究院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.7964。        

本发明提供的菌株WG-007的形态特征与生理生化特征为:

该菌株形态呈短杆状，端圆，单个排列。革兰氏染色红色，在平板上培养24 h后菌落呈现圆形，直径约为2-3 mm，表面光滑，湿润，边缘整齐，两面颜色一致，稍有隆起，颜色为米黄色。无鞭毛,无孢子形成。

生化特性：革兰氏染色为阴性，该菌株可在盐浓度为30%条件下生长，生长温度为15-40℃，但最适生长温度为25 ℃，最适的NaCl 浓度为6.0%。接触酶呈阳性,氧化酶呈阴性, M.R阳性，V.P反应为阴性,可利用葡萄糖，乳糖，甘露醇等;不能水解淀粉,及水解明胶;具有硝酸盐还原性等生理生化特性，见表1。

表1  Cobetiasp.WG-007菌株的生理生化特性

16S rDNA序列比对及系统发育分析: 菌株WG-007的16S rDNA基因全长在该菌株的16S rDNA基因的扩增过程中，扩增出的16S rDNA序列的长度为1508 bp，将该序列信息利用Blast软件在NCBI等数据库中进行同源性搜索，选取同源性高的典型菌株的16S rDNA序列作为参比对象。经同源性比较发现该菌株与Cobetia属的16S rDNA序列相似性为99％，可认为该菌株应属于Cobetia属，将其命名为Cobetia sp. WG-007。根据该菌株已知的生理生化特性查阅伯杰细菌鉴定手册和Cobetia属的相关文献，均与该属特有的生理生化特性相符合。该菌株的基因序列号已递交至GenBank Database,序列编号为KF545599。

本发明的另一个目的是提供一种由菌株WG-007发酵产生的褐藻胶裂解酶及其纯化方法。