[发明专利]一种矮马精液冷冻保存的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种动物精液保存的方法，尤其涉及一种矮马精液冷冻保存的方法。 

背景技术

精液冷冻保存是利用超低温抑制精子细胞的代谢活动，使之处于几乎静止的状态，进行长期保存，解冻后又能回复到正常生理状态。精液冷冻解冻后结合人工授精技术能充分扩大优秀种公畜的利用率，加快品种改良进程和快速扩繁良种畜禽。精液冷冻保存方法的完善对现代畜牧业发展起着非常重要促进作用。 

动物精液冷冻保存技术领域研究的历史悠久，已经开发出许多种动物的精液冷冻保存方法，但不同物种的保存方法存在差异。关于马的精液冷冻保存，国外已经有数十种马精液冷冻稀释液配方的文献报道，国内新疆农业大学、新疆畜牧科学院畜牧研究所、塔里木大学等开展了马精液的冷冻保存方面的研究。现有的马精液的冷冻保存液和冷冻方法仍然不够成熟，主要通过液氮熏蒸进行冷冻，降温速度不能很好地控制，剧烈降温可能会导致精子损伤甚至死亡，冷冻精子质量差，复苏率低，冷冻效果不稳定，难以规模化推广应用。 

矮马指成年体高在106厘米以下的马，英文中称之为pony（与专指大马的horse相对应）。因其小巧玲珑、天资聪颖、性情温顺而深受人们的喜爱。可用于观赏、娱乐、实验和劳役，也是小朋友和老年人很好的“朋友”。因为数量稀少，更显得尤为珍贵，可以说是马中之宝。从文献检索来看，目前还没有涉及矮马精液冷冻保存方面的研究。 

发明内容

本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种可以有效提高矮马精液冷冻保存的质量和效果的矮马精液冷冻保存的方法。 

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案是： 

一种矮马精液冷冻保存的方法，其特征在于，包括以下步骤： 

（1）将鸡蛋的卵黄经高速离心后，取上层卵黄备用； 

（2）制备冷冻保存稀释液，每100mL冷冻保存稀释液中，包括葡萄糖3.4～3.8g、乳糖7.0～7.4g、柠檬酸钠0.2～0.6g、上层卵黄4.8～5.2mL、二甲基酰胺4.8～5.2mL、维生素E0.04～0.08g、青霉素8～12万单位、链霉素8～12万单位；制备时先将除上层卵黄以外的其他组分溶解于适量无菌蒸馏水中，再加入上层卵黄，搅拌25～35min，再用孔径0.3～0.5μm的滤器过滤，即得冷冻保存稀释液。 

（3）采集矮马精液后，过滤去除胶状物质，经离心后除去上层精清； 

（4）按精液、冷冻保存稀释液的体积比3:1的比例，将冷冻保存稀释液缓慢倒入预处理后的精液中，轻轻摇晃使精液与稀释液充分接触、混匀； 

（5）将稀释后的矮马精液分装至细管中封口，使用程序降温仪进行程序化降温，降温程序为：预设20℃启动程序，缓慢降温至5℃停留5min，快速降温至-10℃停留2min，随后快速降温，当温度降至-43℃后，快速取出细管转入液氮中保存。 

优选地，步骤（1）中，鸡蛋的卵黄离心时的转速为10000r/m，离心时间为30min。 

优选地，步骤（2）中，每100mL冷冻保存稀释液中，包括葡萄糖36g、乳糖7.2g、柠檬酸钠0.4g、上层卵黄5.0mL、二甲基酰胺5.0mL、维生素E0.06g、青霉素10万单位、链霉素10万单位；制备时制备时先将除上层卵黄以外的其他组分溶解于适量无菌蒸馏水中，再加入上层卵黄，搅拌30min，再用孔径0.4μm的滤器过滤，即得冷冻保存稀释液。 

优选地，步骤（3）中，采集矮马精液后，用灭菌的双层200目尼龙网过滤去除胶状物质，离心时的转速为1200r/min，离心时间为7min。 

优选地，步骤（4）中，冷冻保存稀释液需先预热到37℃。 

优选地，步骤（5）中，稀释后的矮马精液先在25℃静置1h，再分装至细管中封口。 

通过以上技术方案，本发明的有益效果如下： 

本发明使用的冷冻保存稀释液可以有效延长矮马精子的使用寿命；通过程序化降温有效地控制降温速度，避免精子受到损伤，提高冷冻效果和解冻后精子的质量。 

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和本质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。 

实施例 

1.配制冷冻保存稀释液