[发明专利]对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于环介导等温扩增检测技术领域，尤其涉及了对虾桃拉综合症病毒可视化环介导等温扩增（LAMP）检测试剂及检测方法。

背景技术

对虾桃拉综合症病毒（TSV）是近年来新发现的一种严重危害养殖对虾的病毒，根据国际病毒分类委员会（ICTV）第7次报告，该病毒属于双顺反子病毒科（Dicistroviridae），蜜蜂麻痹病毒属（Aparavirus）。该病毒主要感染太平洋白虾（Pacific white shrimp）、南美白对虾（Penaaeus vannamei）、太平洋蓝虾（Pacific blue shrimp）等。

由于TSV危害严重，成为威胁对虾养殖业的主要疾病之一，因此，1995年被国际兽疫局（OIE）、联合各粮农组织（FAO）以及亚太地区水产养殖发展网络中心（NACA）同时列为必报的水生动物疫病。目前，TSV的检测诊断方法主要包括聚合酶链反应（PCR）检测技术、核酸探针技术和ELISA检测技术等。其中，PCR检测技术以其简便快捷、特异性好、敏感性高等特点被OIE推荐为该病的检测手段之一。

环介导等温扩增（LAMP）技术是2000年Notomi等在PCR基础上创建的另外一种形式的核酸扩增技术。与PCR技术相比，两者最大的差异在于靶基因引物的设计上。其中，PCR只使用一对与靶基因两端序列互补的上下游引物，而LAMP则针对靶基因的6个不同区域、同时使用3对引物对靶基因进行扩增，6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行扩增反应，因此其特异性和敏感性均比PCR更高。

随着新一代生化试剂的不断开发，该技术已实现不开盖就可直接进行可视化检测的水平。在DNA合成时，从脱氧核酸三磷酸基质中析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的镁离子反应，产生大量焦磷酸镁沉淀，呈现白色；或在有钙黄绿素、SYBR Green等颜色指示剂存在的情况下，反应产物呈现出特定的颜色。因此，可以把浑浊度或颜色作为反应的指标，只用肉眼观察到白色浑浊沉淀或特定颜色，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和染色过程。LAMP反应不需要PCR仪和昂贵的试剂，有着广泛的应用前景。但是，目前尚未见有利用环介导等温扩增（LAMP）对对虾桃拉综合症病毒（TSV）进行检测的报道。本发明根据LAMP技术原理，以TSV基因为模板，通过对反应条件和可视化检测条件进行研究，建立了TSV的可视化LAMP快速检测技术，并在临床样品检测中进行了初步应用。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种更方便、特异性强、成本低、通过肉眼直接检测荧光来判断结果的对虾桃拉综合症病毒（TSV）可视化环介导等温扩增（LAMP）检测试剂及检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂，针对对虾桃拉综合征病毒基因组保守区的衣壳蛋白基因序列，设计6条特异性扩增引物，其中包括两条外引物F3和B3、两条内引物FIP和BIP、两条环引物LF和LB。

所述的F3为5'- GGTCCTGGACTTCAAACA -3'；

所述的B3为5'-TTGCGTGGTGGGACTA-3'；

所述的FIP为5'-AGGTTCCACAATCTTGATGAATGAT-CTGTTACATTCTTAGACAGCACTA-3'；

所述的BIP为5'-TCACTGTTAGTAACACTACCTCCT-CCTGCTAACCCAGTCGA-3'；

所述的LF为5'-ATCCCAATCACTAATCAGAATG-3'；

所述的LB为5'-AGTCCTCCACTGGTTGT-3'。

所述的扩增引物加入反应试剂后共同组成LAMP检测液体系，所述的反应试剂包括反应缓冲液Bst DNA polymerase bufferr、链置换DNA聚合酶、镁离子、二价锰离子、甜菜碱、脱氧核糖核苷三磷酸dNTPs、颜色指示剂，余量为水。

作为本发明对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的进一步改进，所述的颜色指示剂为钙黄绿素，或是SYBR Green。

作为本发明对虾桃拉综合症病毒可视化LAMP检测试剂的进一步改进，所述的镁离子为MgSO₄ 溶液溶液；所述的二价锰离子为MnCl₂溶液。