[发明专利]一种多形汉逊酵母遗传操作策略及其应用

权利要求书

1.一种用于对多形汉逊酵母中目的基因进行敲除的DNA片段组，由DNA片段甲和DNA片段乙组成；

沿着5’端至3’端的方向，DNA片段甲的结构为：目的基因5’端序列—m—mazF表达盒—抗性筛选标记基因表达盒部分片段A；

沿着5’端至3’端的方向，DNA片段乙的结构为：抗性筛选标记基因表达盒部分片段B—n—目的基因3’端序列；

抗性筛选标记基因表达盒是用于筛选重组多形汉逊酵母菌的；

mazF表达盒能够在重组多形汉逊酵母菌中表达mazF蛋白；

抗性筛选标记基因表达盒部分片段A为抗性基因表达盒的一部分片段，不是完整的抗性筛选标记基因表达盒，其从抗性筛选标记基因表达盒的5’末端开始至抗性筛选标记基因表达盒的中间某个碱基处结束；抗性筛选标记基因表达盒部分片段B为抗性筛选标记基因表达盒的一部分片段，不是完整的抗性筛选标记基因表达盒，其从抗性筛选标记基因表达盒的中间某个碱基开始至抗性筛选标记基因表达盒3’末端结束；抗性筛选标记基因表达盒部分片段A的3’端与抗性筛选标记基因表达盒部分片段B的5’端有部分重叠序列，该部分重叠序列供DNA片段甲和DNA片段乙发生同源重组从而在汉逊酵母细胞内形成完整的抗性筛选标记基因表达盒；

mazF表达盒中的启动子是甲醇诱导的MOXp启动子；

mazF的氨基酸序列是如SEQ ID No.2所示；

m和n为如下中的任一种：

（1）m为CYC1TT序列，n为CYC1TT序列；

CYC1TT的序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第13位至第383位核苷酸所示；

（2）m为空白序列，n为目的基因5’端上游序列；

（3）m为目的基因3’端下游序列，n为空白序列；

（4）m为空白序列，n为目的基因5’端序列；

（5）m为目的基因3’端序列，n为空白序列。

2.根据权利要求1所述的DNA片段组，其特征在于：所述抗性筛选标记基因为Zeocin抗性基因。

3.根据权利要求1或2所述的DNA片段组，其特征在于：所述mazF表达盒的核苷酸序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第443位至第2697位核苷酸所示；

所述抗性筛选标记基因表达盒部分片段A的核苷酸序列为如SEQ ID No.5中自5’末端起第3721位至第4469位核苷酸所示；

所述抗性筛选标记基因表达盒部分片段B的核苷酸序列为如SEQ ID No.5中自5’末端起第4209位至第4950位核苷酸所示。

4.一种敲除多形汉逊酵母中一个目的基因的方法，包括如下步骤：将权利要求1-3中任一所述的DNA片段甲和DNA片段乙一起转入多形汉逊酵母中，通过所述抗性筛选标记进行抗性筛选获得重组酵母；将所述重组酵母进行甲醇诱导培养，得到目的重组菌，目的重组菌中所述目的基因被敲除、所述抗性筛选标记基因表达盒丢失、所述mazF表达盒丢失。

5.一种敲除多形汉逊酵母中多个目的基因的方法，包括如下步骤：

（1）敲除宿主多形汉逊酵母中的目的基因A：

按照权利要求4所述的方法敲除多形汉逊酵母中的目的基因A，将所得重组菌记作重组菌A；

（2）敲除宿主多形汉逊酵母中的目的基因B：

再将权利要求1-3中任一所述的DNA片段甲和DNA片段乙一起转入重组菌A中，通过所述抗性筛选标记进行抗性筛选获得重组酵母；将所述重组酵母进行甲醇诱导培养，得到目的重组菌，目的重组菌中所述目的基因B和目的基因A均被敲除、所述抗性筛选标记基因表达盒丢失、所述mazF表达盒丢失；

所述步骤（1）中的权利要求4所述的方法中的DNA片段组与所述步骤（2）中的DNA片组不同时含有CYC1TT序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述CYC1TT的序列如SEQ ID No.1中自5’末端起第13位至第383位核苷酸所示。