[发明专利]一种测定交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的方法

说明书

 

技术领域

    本发明涉及生物化学、药物化学与药物分析技术领域，具体涉及一种测定交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的方法。

背景技术

透明质酸是广泛存在于生物体中的一种天然保湿因子，1g透明质酸至少持水600g，透明质酸是由双糖单位D-葡萄糖醛酸与N-乙酰葡糖胺多次重复排列所组成的酸性大分子多糖，广泛地应用于化妆品、食品和医药领域，商品一般用其钠盐，即透明质酸钠（SH）。天然的透明质酸钠凝胶具有良好的生物相容性好，然而因其易被降解，在体内存留时间短，限制其广泛应用。通过化学修饰制备交联凝胶是目前提高或延长其稳定性的主要手段。目前制备交联凝胶常用的方法是以1,4-丁二醇二缩水甘油基醚（l , 4 -butanediol diglycidyl ether , BDDE）、二乙烯基砜(Divinyl sulphone，DVS)、碳二亚胺(Biscarbodimide，EDC)等为交联剂采用一定的工艺技术制成，但是这些交联剂都有一定的刺激性和毒性，交联剂在凝胶制品中的残留量或含量各个国家都有严格的规定。聚乙二醇是一种被世界各国批准的既可食用又可药用的化合物，在医药领域，它不仅常作为口服制剂的辅料，还是一些注射剂常用的载体，无毒，具有良好的生物相容性且易被机体排出体外。用PEG做交联剂制备交联透明质酸钠凝胶已引起人们的广泛关注和高度重视，PEG交联的透明质酸钠凝胶具有明显的优越性和广阔的市场前景。

虽然PEG应用广泛，但无论是在食品还是在药品中，PEG对机体来说都是一种外来的化合物，所以在相关产品中其含量或残留量都有严格的限制，必须进行检测。目前国内外见于报道的分析检测PEG含量或残留量的方法主要有纸色谱、薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱、分光光度法等，但这些方法大都是针对液态样品如疫苗、尿液等液体中PEG的含量进行检测的，对于凝胶中PEG残留量的检测尚未见报道。而且在已报道的上述方法中，纸色谱的分离时间较长，且同薄层色谱一样，难以对PEG进行精确定量。气相色谱和高效液相色谱是对PEG进行定量检测的常用方法，然而气相色谱所测定的PEG分子量较低，1000Da为最高上限，且分子量大于500的PEG需进行衍生化后再检测，衍生步骤耗时且衍生物稳定性不高。高效液相色谱可对PEG进行分离和定量，大多数高效液相色谱方法使用的是示差折光检测器，而这种方法由于灵敏度低应用范围也不普遍，而且液相色谱仪器设备投资大，并且所需试剂耗材昂贵。分光光度法测定PEG含量主要有D试剂法和氯化钡法。由于D试剂法配制试剂过程繁琐且不稳定易降解，硝酸铋价格昂贵，且该方法的最低检测限偏高（大于2μg/mL）而使其应用越来越少。Childs于1975年首次建立了PEG的氯化钡检测法，其基本原理为PEG与钡离子和碘离子形成复合物（1:1:1），在535nm处的光密度值与PEG的含量呈线性关系进行检测，后经B. Skoog和G.E.C.Sims及T.J.Snape改进，至今仍在应用。然而B. Skoog报道的PEG的最低检测限是5 μg/mL，G.E.C.Sims和T.J.Snape的研究结果中PEG的含量低于2 μg/mL时就检测不到，而在医学美容等领域相关交联凝胶产品中的交联剂的残留量一般应小于2 μg/mL才算符合要求，目前还缺乏采用分光光度法检测出凝胶中PEG600-20000残留量小于2 μg/mL的相关技术和方法。

发明内容

本发明针对已有技术的不足，提供一种交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的测定方法，通过提供一种凝胶样品的前处理或预处理方法，再加上一种非常规标准曲线的制作，建立了一种可简单、快速检测交联透明质酸钠钠凝胶中PEG残留量（小于2 μg/mL）的痕量分析方法。该方法对凝胶样品进行特殊的预处理，用95%或无水乙醇沉淀该凝胶，离心取上清液检测其聚乙二醇残留量。依据PEG与钡离子和碘离子形成1:1:1的复合物的光密度与PEG的含量在535nm处呈线性关系的原理，检测凝胶样品中PEG的残留量。该方法与其他方法相比，可以大大降低实验成本且灵敏度高，稳定性好，简单安全，方便快捷。

该测定交联透明质酸钠凝胶中聚乙二醇残留量的方法包括以下工艺步骤：

    （1）样品预处理

交联透明质酸钠凝胶的样品预处理：将PEG交联的透明质酸钠凝胶用7-14倍体积的95%乙醇或无水乙醇醇沉多次，对所得沉淀干燥并粉碎，将部分粉碎后的颗粒或粉末在108-124℃下复溶10-30min，精密称取复溶后的凝胶1.0g，加入2 mL无水乙醇，密封，经漩涡振荡器振荡，使凝胶沉淀，然后于5000-18000r/min离心3-30min，取上清液待测；