[发明专利]用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种多聚核苷酸的测序方法，具体涉及一种对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，适用于从基因组文库中对未知序列进行筛选。

背景技术

近年来测序技术发展迅猛，已成为生物学研究的重要手段。高通量测序技术的兴起，使大规模低成本研究DNA序列成为可能。全基因组De novo测序也叫做基因组从头测序，是指不依赖于任何已知基因组序列信息对某个物种的基因组进行测序，然后应用生物信息学手段对测序序列进行拼接和组装，最终获得该物种基因组序列图谱。但全基因组由于数据庞大，结构复杂，给全序列的拼接和组装造成了一定的困难。如果研究者感兴趣的只是某一特定片段，全基因组测序周期长、费用高、冗余序列过多的问题就十分明显。

染色体步移（Chromosome Walking）是一种重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。这种方法是从第一个重组克隆插入片段的一端分离出一个片段作为探针从文库中筛选第二个重组克隆，该克隆插入片段含有与探针重叠顺序和染色体的其他顺序。从第二个重组克隆的插入片段再分离出末端小片段筛选第三个重组克隆，如此重复，得到一个相邻的片段。这种方法步骤繁琐，通量过低，只适用于小量测序要求，面对大批量的样品和位点则无能为力。

目前对于已知序列两侧未知侧翼的捕获通常采用cDNA末端快速扩增技术（rapid amplification of cDNA ends，RACE），是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3′端和5′端的方法，可从低丰度的转录本中快速扩增cDNA的5′和3′末端。此方法利用逆转录、TdT加尾和PCR扩增等多步反应，得到5′或3′末端。还可以从两个有相互重叠序列的3′和5′RACE产物中获得全长cDNA，或者通过分析RACE产物的3′和5′端序列，合成相应引物来扩增mRNA的反转录产物，从而获得全长cDNA。

RACE技术主要用于对cDNA的获取，对于基因组范围的未知序列捕获作用有限。此方法步骤繁琐，实际操作中还会受到多步酶促反应效率的限制，应用范围有限；只能得到mRNA的序列，对mRNA前后的序列无法捕获分析；依赖于高质量的反转录酶（具有通读复杂二级结构的能力、具有较高的反应温度）和高质量的RNA，对样品要求较高。

对于全基因组范围侧翼序列捕获及测序，研究者在进行研究时往往会遇到DNA序列只知道一部分的情况，在对基因进行全面研究时无法对其全貌进行描述，进而无法精确研究其功能。如果有方法能够得到基因全序列甚至拼接处完整的基因组DNA序列，那么对于研究的进行将会是事半功倍的效用。但是在全基因组范围内筛选含有已知位点的DNA序列是研究的难点所在。

发明内容

本发明的一个方面在于提供一种用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，从基因组文库中对未知序列进行筛选。

本发明提供的用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，包括构建文库、侧翼序列捕获及测序三部分。

文库构建是将多聚核苷酸制成2Kb-5Kb的片段后，连接到质粒载体，然后转入第一感受态细胞进行扩大培养，获得混合质粒库。

侧翼序列捕获是在未知序列附近的已知序列上设计PCR引物，并对混合质粒库进行扩增，并将消化的扩增产物转化入第二感受态细胞中，培养并获得克隆。

测序是对获得克隆进行测序，并利用生物信息学的手段，捕获已知序列周围的侧翼序列。

本发明测序方法，其引物参照点突变引物设计的原则如下：

（1）通常引物长度为25bp～45bp，优选引物长度为30bp～35bp。一般都是以拟突变的目标碱基为中心，在两侧加上一段序列，两侧的长度至少为11bp～12bp。若两边引物太短，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11bp～12bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求引物的两侧都能与模板搭上，所以更优选的，引物两侧各设至少12bp，并且合成一条反向互补的引物。

（2）引物的Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。Tm值计算公式：Tm=0.41×(%of GC)–675/L+81.5，（L：引物碱基数；%of GC：引物GC含量）

一种具体的实施方式，本发明提供的用于对已知序列两侧未知侧翼序列测序的方法，包括以下步骤

首先，文库构建：