[发明专利]体外培养肝样细胞的方法及采用该方法培养的优化后肝样细胞

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种获得优化后肝样细胞的体外培养方法以及采用该方法获得的优化后肝样细胞。所述体外培养方法包括采用三明治细胞培养法、无血清培养和诱导培养基。获得的优化后肝样细胞接近原代肝脏细胞的结构和功能，其药物转运体、胆酸转运体和/或胆酸合成酶的表达水平显著高于传统肝样细胞；其药物胆汁分泌指数(BEI)和内在胆汁清除率(CLb,int)显著高于传统肝样细胞；其出现药物转运体的极化表达。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种体外培养肝样细胞的方法以及采用该方法培养的优化后肝样细胞。

背景技术

肝脏是决定药物代谢和毒性作用的主要器官，也是多种病毒性肝炎、肝脏肿瘤疾病的靶器官。目前，在制药工业界，原代肝细胞(包括人和动物原代肝细胞)因其药物代谢酶和药物转运体的表达和新药研发以及临床现象有比较好的相关性，被称为药物动力学研究的黄金标准，同时也是肝移植和生物反应器的宝贵资源(Sinz,Wallace et al.2008)。目前原代肝细胞的国际市场保守估计在20亿美元。但是，原代肝细胞不能传代，多种蛋白质表达下降，加上价格昂贵和供体依赖性，限制了它在科研和临床上的进一步使用。因此，无论是科研还是制药工业实践中迫切需要一种功能与肝细胞类似、可稳定传代、可靠且易得的功能性肝细胞。

2010年的FDA白皮书首次指出，药物转运体在新药研发中具有和药物代谢酶同等重要的地位，并且规定了7种必须考察的药物转运体，其中有5种药物转运体在肝脏的代谢、解毒中起到重大作用(International Transporter,Giacomini et al.2010)。这一内容在2012年FDA药物相互作用指南中被确定了下来。

但是，目前可以获得的类似肝脏细胞的细胞株有各种缺点，尤其是没有具备合适的药物转运体表达，无法用于肝脏相关的药物肝胆分布和代谢、毒性研究。例如，最通用的肝脏来源细胞株HepG2上面几乎没有重要的药物转运体表达，更不用说胆管类似结构了。目前公认最接近原代肝细胞的细胞株HepaRG，虽然药物代谢酶CYP3A4表达较为丰富并且可以诱导，但是其药物转运体表达仅仅有Pgp得到承认，而且通过免疫组化试验显示，不能达到极化表达(Andersson,Kanebratt et al.2012)(参见附图4)。

近年来，许多体外试验证实可将胚胎干细胞或者诱导多功能干细胞分化为 肝样细胞，但是，这些技术受供体来源(来自于胚胎的ES细胞)和诱导产生过程高成本和复杂性(来源于人类上皮细胞的iPS细胞，需要进行转分化三部曲)所限，无法提供合适的肝样细胞用于药物研发(Jensen,Hyllner et al.2009)。虽然有多篇文献报道这些细胞具备了一定的药物代谢酶表达，但是对于药物转运体的表达鲜有报道，而且无法令人满意。目前国际上最新的直接转分化技术，可以将小鼠成纤维细胞分化成鼠源诱导肝样细胞(inducedhepatocyte-like cell,iHep)。虽然iHep在形态、功能和应用上和现有细胞系相比有很多优点，但是，iHep在转运体的表达方面并没有显著提高(图1)。在药物转运体和胆酸合成分泌方面并不成熟，没有形成药物转运体的极化表达和可以检测的胆酸合成分泌能力。事实上，胆酸的合成分泌和药物的解毒能力是成熟肝细胞的重要标志。实验数据显示，在现有的iHep细胞中，药物转运体及胆酸相关的合成酶和转运体的表达量与其在小鼠原代肝细胞中的表达量相比极低，仅为5-10%(图1)。类似地，采用直接转分化技术也可以由人源非肝脏细胞获得人源诱导肝样细胞(human induced hepatocyte-like cell,HiHep)，但该细胞也同样具有上述缺陷。

发明内容

技术问题