[发明专利]体外培养肝样细胞的方法及采用该方法培养的优化后肝样细胞

权利要求书

1.一种获得优化后肝样细胞的体外培养方法，其包括：

步骤1、采用三明治细胞培养法培养传统肝样细胞；

步骤2、撤除原有培养基，换用诱导培养基继续培养3-5天，获得优化后肝样细胞；

其中，所述诱导培养基为无血清培养基，并且所述诱导培养基含有选自cAMP、3MC、PB、TCA和VPA中的一种核受体激动剂，或者含有cAMP和PB，或者含有cAMP、3MC和PB，或者含有cAMP、PB和TCA，或者含有cAMP、3MC、PB和TCA，上述各核受体激动剂在所述诱导培养基中的浓度范围分别为cAMP 1-10μM、3MC 1-10μM、PB 10-100μM、TCA 5-50μM和VPA 0.2-4μM；

其中，所述传统肝样细胞为直接转分化技术和胚胎干细胞或多功能干细胞诱导分化技术诱导的肝样细胞；

其中，所述传统肝样细胞转染了肝细胞核因子，所述肝细胞核因子选自肝细胞核因子4α(Hnf4α)和肝细胞核因子4A(HNF4A)。

2.根据权利要求1所述的体外培养方法，其中，

所述诱导培养基含有浓度为2μM的cAMP和浓度为50μM的PB，或者含有浓度为2μM的cAMP、浓度为2μM的3MC和浓度为50μM的PB，或者含有浓度为2μM的cAMP、浓度为50μM的PB和浓度为20μM的TCA，或者含有浓度为2μM的cAMP、浓度为2μM的3MC、浓度为50μM的PB和浓度为20μM的TCA。

3.根据权利要求1所述的体外培养方法，其中，

所述传统肝样细胞为小鼠源、大鼠源或人源传统肝样细胞。

4.根据权利要求3所述的体外培养方法，其中，

所述鼠源传统肝样细胞为利用直接转分化技术，由鼠源非肝脏细胞获得的；所述人源传统肝样细胞为利用直接转分化技术，由人源非肝脏细胞获得的。

5.根据权利要求4所述的体外培养方法，其中，所述鼠源非肝脏细胞为鼠尾成纤维细胞或者鼠胚胎成纤维细胞；所述人源非肝脏细胞为人类胚胎成纤维细胞。

6.根据权利要求3-5中任一项所述的体外培养方法，其中，

所述鼠源传统肝样细胞转染了肝细胞核因子4α(Hnf4α)；所述人源传统肝样细胞转染了肝细胞核因子4A(HNF4A)。

7.一种优化后肝样细胞，所述细胞通过权利要求1至6中任一项所述的体外培养方法获得。

8.根据权利要求7所述的优化后肝样细胞，其药物转运体的表达水平为传统肝样细胞的一倍以上；和/或其胆酸转运体的表达水平显著高于传统肝样细胞；和/或其胆酸合成酶的表达水平显著高于传统肝样细胞；和/或其药物胆汁分泌指数(BEI)和内在胆汁清除率(CLb,int)显著高于传统肝样细胞；和/或其出现药物转运体的极化表达。

9.根据权利要求8所述的优化后肝样细胞，其中，所述胆酸转运体为Bsep、Mrp2和/或Ntcp；所述药物转运体为P-gp、Bcrp、Oatp1b2、Oatp1a1和/或Oatp1a4；所述胆酸合成酶为Cyp7a1。