[发明专利]一种细菌漆酶突变体蛋白、其重组表达质粒、转化的工程菌株及其发酵制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及通过定向改造方法构建的稳定性提高的细菌漆酶突变体蛋白，及其在重组大肠杆菌中的高密度培养生产方法，属于酶的基因工程技术和发酵工程技术领域。 

背景技术

漆酶(Laccase，EC 1.10.3.2)是一种含铜的多酚氧化酶，具有广泛的底物作用范围，能催化氧化多种酚类和非酚类化合物，在木质素类物质降解、酚类物质(如苯氧基类除草剂等)毒性去除、新型化合物合成等方面发挥重要作用。漆酶广泛存在于真菌和细菌中。真菌漆酶可在酸性或中性偏酸性条件下发挥活性，部分真菌漆酶已应用于工业生产当中。与真菌漆酶相比，细菌漆酶可在碱性条件下发挥催化活性，部分细菌漆酶还具有真菌漆酶不具有的生物活性，如高卤族离子耐受活性等，可应用于真菌漆酶无法应用的现代生物技术产业。因此，细菌漆酶可作为真菌漆酶的重要补充，拓展漆酶的工业应用范围。 

细菌漆酶研究目前主要集中于新酶的发现和酶学性质分析。已有研究表明，部分细菌漆酶具有工业应用价值。然而，现有细菌漆酶性质不能满足现代工业生物技术对细菌漆酶的系列要求，如同时具有温度稳定性和氯离子耐受性等，从而阻碍了细菌漆酶的工业化应用进程。分子生物学技术的发展，为酶蛋白的定向改造提供了途径。现有证据表明，通过分子生物学技术手段，结合生物信息学相关理论，对候选细菌漆酶进行定向改造，改良细菌漆酶性质，具有完全的可行性。 

大肠杆菌由于其遗传学、生物化学和分子生物学等方面已充分被人们了解而成为表达异源蛋白的首选表达系统。大肠杆菌容易培养且费用低、对多种蛋白具有良好的耐受能力、能高水平的表达异源蛋白；同时，大肠杆菌可进行高密度发酵，可进一步降低生产成本。因此，利用大肠杆菌表达系统近年在生物药物制备、酶制剂生产等方面被广泛采用。 

发明内容

本发明的首要目的在于提供一种运用定向改造方法获得的稳定性提高的细菌漆酶突变体蛋白的氨基酸序列，该序列由SEQ ID No.1所示的细菌漆酶的氨基酸序列第323位甘氨酸至332位甘氨酸进行缺失突变后获得。 

本发明的第二个目的在于提供一种上述细菌漆酶突变体蛋白的DNA编码序列及含有该DNA序列的一种表达质粒。 

本发明的第三个目的在于提供一种转化有上述重组表达质粒的生产菌株，该菌株具有细 菌漆酶突变体蛋白合成性能。 

本发明的第四个目的在于提供一种高密度培养发酵制备上述细菌漆酶突变体蛋白的方法。 

本发明中的一种细菌漆酶突变体，所述突变体的蛋白氨基酸序列还可以包括序列中的无义突变或同义突变的组合。 

本发明具体技术方案如下： 

对细菌漆酶Lac15(GenBank Accession No.ADM87301)进行生物信息学分析和稳定性试验，确定氨基酸序列323GAMSRRMMQG332为柔性可变区域，野生型蛋白长时间保存过程中，该区域氨基酸出现断裂，并引发蛋白降解。因此，本发明的主要技术方案围绕氨基酸序列柔性可变区域进行缺失突变，进而以Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-lac15(Del)为出发菌株，以指数补料和恒速补料相结合的方式，对重组大肠杆菌进行高密度发酵生产细菌漆酶突变体蛋白Lac15(Del)。 

具体操作步骤如下： 

1.以细菌漆酶Lac15(GenBank Accession No.ADM87301)为模板，选择第323位到332位的10个氨基酸(323GAMSRRMMQG332)，利用PCR方法进行缺失突变，并将该突变体基因连接到表达载体pET22b(+)中，构建表达质粒pET22b(+)-lac15(Del)并转化进入工程菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行诱导表达。