[发明专利]一种细菌漆酶突变体蛋白、其重组表达质粒、转化的工程菌株及其发酵制备方法

权利要求书

1.一种细菌漆酶突变体蛋白，其特征在于，该突变体蛋白氨基酸序列由SEQ ID No.1所示的细菌漆酶氨基酸序列第323位甘氨酸至332位甘氨酸进行缺失突变获得。 

2.编码权利要求1所述的一种细菌漆酶突变体蛋白的DNA，所述DNA序列如SEQ ID No.2所示。 

3.一种细菌漆酶突变体蛋白表达质粒，其特征在于，含有权利要求2所述的细菌漆酶突变体蛋白的DNA序列。 

4.一种具有细菌漆酶突变体蛋白合成性能的工程菌，其特征在于，含有权利要求3所述的表达质粒。 

5.一种细菌漆酶突变体蛋白，其特征在于，由权利要求4所述的工程菌发酵获得。 

6.一种利用重组大肠杆菌高密度培养生产细菌漆酶突变体蛋白的方法：其特征在于，以权利要求4所述工程菌为出发菌株，以改良的TB培养基为初始发酵培养基，初始接种量为5-7%。培养过程中，当培养基中甘油耗尽、发酵液溶氧DO上升幅度超过30%时，按照如下计算公式速率流加补料培养基： 

F_（t）=(μ_setX₀V₀/Y_X/SS_F)exp(μ_sett)； 

其中，F_（t）：补料流加速率，单位：L·h^-1；X₀：流加补料时的初始生物量，单位：g·L^-1；V₀：发酵液初始体积，单位：L；S_F：补料中甘油浓度，单位：_g·L^-1；μ_set：比生长速率为0.1-0.2h^-1；Y_X/S：细胞对底物的得率系数，单位：g·g^-1；t：补料开始时间，单位：h； 

当菌体干重达到17-26g·L^-1，加入终浓度为0.05-0.2mM的IPTG进行诱导，以6-18mL·h^-1的速率恒速流加补料培养基，诱导8-10h后结束。 

7.按照权利要求6所述方法，其特征在于，所述发酵温度为28-30℃；所述发酵培养基pH范围为7.0-7.3。 

8.按照权利要求6所述方法，其特征在于，所述改良的TB培养基为：甘油15-20g·L^-1，酵母粉20-26g·L^-1，胰蛋白胨10-12g·L^-1，KH₂PO₄17mM，K₂HPO₄72mM，使用时添加氨苄青霉素至终浓度100μg·mL^-1；所述补料培养基为：甘油450-500g·L^-1，酵母粉40-50g·L^-1，蛋白胨40-50g·L^-1，使用时添加氨苄青霉素至终浓度100μg·mL^-1。 

9.一种重组表达菌株E.coli BL21(DE3)，其特征在于，所述菌株保藏编号为CCTCC M2013598。